Hogyan jut a metilénkék a sejtekbe: redukció, reoxidáció és membránmegoszlás

Ha megfigyeljük, ahogy egy tenyésztőedényben az endotélsejtek metilénkéket vesznek fel, a kézenfekvő értelmezés egyben a téves is. A közeg elveszíti kék színét, a sejtekben kék szemcsék jelennek meg, tehát a festéknek kék molekulaként kellett áthaladnia a membránon. A kísérletek azonban mást mutatnak. A kék forma alig jut át. A színtelen forma az, amelyik áthalad, a bent látható kék forma pedig a bejutás után, odabent keletkezik.

Ez a fordított sorrend azért fontos, mert meghatározza, hogy mit árulhat el a festődés, és mit nem. A kék szemcsék olyan oxidált festéket jeleznek, amely reoxidálódott és a sejtszervecskékben rekedt. Nem jelzik a sejtben lévő festék teljes mennyiségét, nem mutatják a redukált készletet, és nem mérik a biológiai hatást. Ennek megértéséhez kövessük végig a három lépést: redukció a felszínen, a redukált forma diffúziója, majd reoxidáció és visszatartás a sejten belül.

A két forma különböző molekulákként viselkedik

Az oxidált metilénkék sík, pozitív töltésű gyűrűrendszer. Vízben oldódik, a 600 és 700 nanométer közötti tartományban erősen elnyeli a fényt, és kéknek látszik. A töltés a lényeg. Egy töltött, vízkedvelő molekula nem jut át könnyen a lipidmembránon, ezért a szakirodalom körültekintő megfogalmazása szerint a membrán viszonylag rosszul átjárható számára, nem pedig teljesen átjárhatatlan.

A redukált metilénkék, az úgynevezett leukometilénkék, színtelen, töltés nélküli és zsíroldékony. A töltés eltűnésével a membrán már nem jelent falat. A redukált molekula könnyen átdiffundál rajta, majd egy oxidálóbb sejten belüli térbe kerülve ismét elektronokat adhat le, és visszaalakulhat a kék, töltött, bent rekedő formává. A festék redoxkémiája tehát egyben a szállítási mechanizmusa is. Az elektronszám megváltoztatásával a membránon való átjutás képessége is megváltozik.

Az első lépéshez szükséges elektronok magából a sejtből származnak. Az emlőssejtek a plazmamembránon át is végeznek elektronszállítást: a sejten belüli donoroktól redukáló ekvivalenseket juttatnak a felszíni akceptorokhoz. Ez a plazmamembránon át zajló tevékenység normális sejtfunkció, amely a legtöbb sejttípusban megtalálható. Az endotél felszínén a tiazin festékeket redukáló enzim pedig egy sokatmondó szempontból a többi hasonló enzimhez hasonlóan viselkedik: cianid és azid jelenlétében is tovább működik olyan koncentrációknál, amelyek a későbbi lépéseket leállítják. Ez a szétválaszthatóság az egész történet kulcsa.

Először a megoszlást vizsgálták, és ez majdnem megmagyarázta a felvételt

1929-ben Marian Irwin a Rockefeller Intézetben egy egyszerűbb kérdést tett fel. Lehetséges, hogy a festék bejutása csupán a víz és a sejt zsíros rétegei közötti megoszlás eredménye, és a laboratóriumban egy kloroformréteg helyettesítheti ezeket a zsíros rétegeket? Spektrofotometriás behatolási vizsgálataiban vizes festékoldatokat rázott össze kloroformmal, majd összehasonlította, hogy mi került a szerves fázisba, és mi jutott be élő algasejtekbe.

Ebből a munkából két megállapítás ma is figyelmet érdemel. Először is, a kereskedelmi metilénkékoldatok trimetil-tionint tartalmaztak, amelyet ma Azure B néven ismerünk, és ez a szennyeződés gyorsabban jutott be, mint maga a metilénkék. Ez különösen lúgos pH-n volt így, ahol a lipidoldékony szabad bázisforma van túlsúlyban. A metilénkék látszólagos bejutásának egy része valójában az Azure B szelektív bejutása volt. Másodszor, a pH az ionizációs állapot meghatározásán keresztül befolyásolta az eredményt, és a sérült sejtek sokkal több festéket engedtek be, mint az épek. A megoszlási együtthatók és a töltési állapot határozták meg, hogy mit vett fel a mesterséges rendszer, illetve az élő sejt, a kettő közötti hasonlóság pedig alátámasztotta a sejthatár nem vizes rétegeinek elképzelését.

A modell előrelátó volt a lipidek és az ionizáció szerepét illetően, de nem tudott különbséget tenni a változatlan formában megoszló festék és az olyan festék között, amely a felszínen kémiailag átalakul, más formában jut át, majd odabent visszaalakul. Ehhez a különbségtételhez más kísérlet kellett, amelyre hetven évvel később, a tüdő endotélsejtjeiben került sor.

Redukció kívül, visszatartás belül

Merker és munkatársai tenyésztett szarvasmarha-tüdőartéria-endotélsejtekkel dolgoztak, és háromlépéses folyamatot javasoltak: az oxidált festék a sejtfelszínen színtelen, lipofil formájává redukálódik, a redukált forma bediffundál, majd a sejten belüli reoxidáció újra létrehozza a membránon át nem jutó oxidált formát, amely felhalmozódik. Az endotélsejtek tiazin-felvételéről szóló vizsgálatukban ezután úgy tesztelték ezt a folyamatot, hogy meghatározott pontokon próbálták megszakítani.

Az első eszköz a ferricianid volt, egy elektronakceptor, amely nem tud bejutni a sejtbe. Amikor a felszíni enzimek a sejten kívül színtelen formává redukálják a kék festéket, a ferricianid visszaveheti ezeket az elektronokat, így a közegben újra kék festék keletkezik, még mielőtt az áthaladhatna a membránon. Amíg a ferricianid feleslegben volt jelen (10 mikromoláris festék mellett 50 és 500 mikromoláris közötti ferricianid), a festékfelvétel szinte leállt, és csak a ferricianid elfogyása után indult újra a szokásos sebességgel. A kinetika más módon is ugyanezt mutatta. A ferricianid nagyjából állandó sebességgel fogyott, összhangban egy újrahasznosítható közvetítőt tápláló, folyamatos felszíni redukciós fluxussal, miközben a sejten kívüli festék mennyisége exponenciálisan csökkent, ahogy a készlete kiürült. Az állandó fluxus és a fogyó készlet együtt azt jelenti, hogy a ferricianid jele a folyamatos redukciót mutatja, nem pedig a festékmolekulák távozását az oldatból.

A második eszköz teljesen kiiktatta a membránon való áthaladás lépését. A csoport a tiazinok közeli rokonát, a toluidinkék O-t egy nagy poliakrilamidlánchoz kapcsolta, amely túl nagy volt ahhoz, hogy bármelyik oxidációs állapotban bejusson a sejtbe. A sejtek ennek ellenére redukálták a rögzített festéket. A redukcióhoz tehát nincs szükség sejten belüli hozzáférésre. A folyamatot végző apparátus a felszínen hozzáférhető, vagy elektromosan kapcsolódik hozzá.

Ezután következett az a szétválasztás, amely a tanulmány címét adja. A cianid és az azid 2 millimoláris koncentrációban erősen visszaszorította a festék felhalmozódását, és a mikroszkóp alatt szinte eltűntek azok a sötétkék és lila zárványok, amelyek rendesen körülveszik a sejtmagot. Ugyanakkor egyik gátlószer sem lassította a sejten kívüli redukciót: a ferricianid körforgása változatlanul folytatódott, és a membránon át nem jutó polimerhez kötött festék is tovább redukálódott. A gátlás a folyamat későbbi szakaszában volt. A cianid és az azid a sejten belüli reoxidációt és elkülönítést állította le, nem a felszíni redukciót. Az életképességi kontrollok alátámasztották ezt az értelmezést, mert a sejtek a kezelések során megtartották citoszolikus marker enzimüket, a laktát-dehidrogenázt, így a felvétel megszűnése nem pusztán mérgezés vagy membránsérülés következménye volt.

A tanulmány egyik óvatosságra intő megállapítása ma is érvényes. A kék zárványok a sejtmag körül, de nem a sejtmagban helyezkedtek el, ami összhangban van a sejtszervecskéken belüli oxidációval, a vizsgálat azonban nem azonosította, hogy mely sejtszervecskékről van szó. Más sejttípusok hasonló mintázatait gyenge bizonyítékok alapján lizoszomálisnak nevezték. A visszatartást tekintsük igazoltnak, a pontos helyét azonban egyelőre feltételezésnek. Akik azt követik nyomon, hová kerülnek ezután az elektronok, a mitokondriális elektronszállításról és redoxfolyamatokról, illetve a bejuttatási út szerinti felszívódás és eloszlás tágabb összefüggéseiről olvashatnak tovább.

A festődés nem azonos az expozícióval

Egy harmadik vizsgálat azt mutatja meg, mi történik, amikor ez a felvételi mechanizmus egy biológiai mérési végponttal találkozik. Scott és munkatársai megállapították, hogy a metil-béta-ciklodextrin, egy gyűrű alakú cukortórusz, közvetlenül kötődik a metilénkékhez. A zárványkomplex asszociációs állandója körülbelül 310 inverz moláris, míg a festék dimerizációjáé körülbelül 5846 inverz moláris. L929 fibroblasztokban ez a kötődés mind a sejtfestődést, mind a glükózfelvétel fokozódását gátolta: a ciklodextrinnel végzett előinkubálás megakadályozta a kék festődést, utólagos hozzáadása pedig felgyorsította a festődés megszűnését. Ahogy az optikai kék jel eltűnt a sejtekből, a fokozott glükóztranszport is szorosan vele párhuzamosan csökkent.

A szerzők ezt az összefüggést úgy értelmezték, hogy inkább a festék és a glükóztranszporter aktiválási útvonalában szereplő valamely fehérje közvetlen kölcsönhatását támasztja alá, mint egy tartós oxidatívstressz-mechanizmust. Ez a következtetés észszerű, de korlátozott. A kísérlet nem nevezi meg a fehérjét, nem mutatja ki a magához a transzporterhez való kötődést, és a festődés megszűnése és a hatás elvesztése közötti korreláció nem zárhat ki minden redoxközvetített útvonalat.

A maradandó tanulság a mérésre vonatkozik. Az optikai festődés a látható, oxidált, sejthez társult festéket jelzi. A színtelen, redukált készletet teljesen figyelmen kívül hagyja, ezért egy halvány sejt is tartalmazhat festékekvivalenseket, egy erősen festődő sejt pedig visszatartott oxidált festéket jelez, nem a teljes szöveti expozíciót vagy a hatás nagyságát. Ugyanez az óvatosság nagyobb léptékben is érvényes: a festődés sejttípusok közötti összehasonlítása vagy egy sötét szövetmetszet nagyobb expozíció bizonyítékaként való kezelése megismétli a tenyésztőedény megfigyeléséből eredő kezdeti tévedést. A felvétel a redukció, a diffúzió és a reoxidáció körfolyamata, és a kék formáról készült bármely pillanatfelvétel ennek csak egy részét mutatja. A laboratóriumi festésre és kezelésre, valamint a dózissal és expozícióval kapcsolatos állítások értelmezésére vonatkozó gyakorlati következmények közvetlenül ebből adódnak.