Paul Ehrlich i metilensko modrilo: kako je bojilo pomoglo oblikovati otkrivanje lijekova

Doprinos Paula Ehrlicha medicini nije bio lijek. Bio je to argument o tome kako promatrati lijek.

Godine 1878 predao je doktorsku disertaciju čiji je uvodni dio nosio naslov „Kemijsko poimanje bojenja”. U njoj je tvrdio da bojenje tkivnog presjeka i bojenje komada tkanine slijede istu logiku. U oba slučaja boja se veže zbog kemijskog afiniteta između bojila i materijala, a ne zato što tkivo upija, sadrži masnoću ili ima oblik koji zadržava pigment. Ehrlich je odrastao gledajući svojeg rođaka, patologa Karla Weigerta, kako priprema obojene presjeke. Pažnju mu nisu zaokupljale slike, nego činjenica da bojilo odabire kamo će otići.

Tvrdnja zvuči skromno. Nije takva. Ako se bojilo veže za tkivo iz kemijskih razloga, tada obrazac bojenja govori o kemiji tog tkiva. Obojeni preparat prestaje biti ilustracija i postaje mjerenje.

Odmah je nastavio razvijati tu ideju. Godine 1880 kombinirao je metilensko modrilo s kiselim fuksinom i smjesu nazvao neutralnim bojilom, neutralnim obojenim spojem, koje je razlikovalo vrste bijelih krvnih stanica ondje gdje pojedinačna bojila tada u uporabi to nisu mogla. Dvije godine poslije predstavio je metodu bojenja bacila tuberkuloze metilnim ljubičastim, a Koch je taj postupak prihvatio u vlastitom radu.

Teorija koja je kasnije tim postupcima dala zajednički temelj zasebna je tema, a vrijeme njezina nastanka rutinski se pojednostavljuje. Ehrlichova teorija bočnih lanaca, ideja da tvar djeluje na stanicu zato što su kemijski kompatibilne, pripada 1890-ima, a ne godinama pokusa s bojilima. Raniji rad pružio je prethodno uvjerenje: selektivnost je kemijska pa ju se može ciljano tražiti, umjesto na nju slučajno naići.

Pokus koji je bojilo pretvorio u kartu

Godine 1885 Ehrlich je objavio monografiju o potrebama organizma za kisikom, s podnaslovom koji ju je opisivao kao analitičko istraživanje pomoću boje. Metoda se sastojala od ubrizgavanja bojila čija boja ovisi o oksidacijskom stanju, a zatim usporedbe načina na koji ih različiti organi reduciraju ili zadržavaju nepromijenjenima. Bojilo se upotrebljavalo kao instrument, poput termometra: izvještavalo je o uvjetima unutar tkiva koji se nisu mogli izravno ispitati. Sam Ehrlich cilj je opisao kao određivanje redukcijske moći živih organa uz pomoć određenih bojila.

Rezultat s metilenskim modrilom objavljen je 1886 u radu o reakciji bojila sa živim živčanim tkivom, koji je prethodnog prosinca pročitan pred liječničkim društvom. Metilensko modrilo uneseno je u krvotok žive životinje, nakon čega su izvađeni tanki presjeci tkiva i izloženi zraku kako bi se nakupljeno bezbojno bojilo oksidiralo natrag u plavo te pokazalo gdje se prikupilo. Živčane stanice i živčana vlakna poprimili su boju, i to dovoljno selektivno da je tehnika postala standardna metoda prikazivanja živčanog tkiva. Spoj više nije bio samo tvar za bojenje nanesena na mrtvi presjek na laboratorijskom stolu. Bio je biljeg koji se raspoređivao unutar živog tijela, a taj se raspored mogao očitati.

Svojstvo na kojem se temelje oba pokusa zaslužuje jasno objašnjenje jer sve ostalo u ovoj priči ovisi o njemu. Promjena metilenskog modrila je reverzibilna. Njegov reducirani oblik, leukometilensko modrilo, bezbojan je, a u dodiru s kisikom ponovno prelazi u plavi kation. Otopina bojila u otopini glukoze u zatvorenoj staklenci bezbojna je; otvorite staklenku i postaje plava. Prema navodima, Ehrlich je to izravno pokazao tako što je obojene presjeke tretirao željezovim kloridom i zrakom te promatrao povratak boje. Bojilo koje mijenja boju s redoks-stanjem svoje okoline služi kao sonda za tu okolinu.

Tako su jedno uz drugo stajala dva svojstva. Bojilo je moglo razlikovati jedno tkivo od drugoga. A promjenom oksidacijskog stanja boja se mogla uključivati i isključivati.

Gledano unatrag, drugo je svojstvo početak kemoterapije. Ako se spoj veže za jednu vrstu tkiva, a ne za drugu, isti bi spoj mogao doprijeti do jedne vrste organizma, a ne do druge. Ehrlich je taj zaključak iznio izravno: ako se patogen može selektivno obojiti, bojenje bi moglo upućivati na specifično štetno djelovanje na taj patogen. Bojilo bi se stoga moglo upotrebljavati kao lijek usmjeren na napadača, a ne na pacijenta.

Prvo ispitivanje na pacijentu nije bilo za malariju. Godine 1890 Ehrlich je sa psihijatrom Arthurom Leppmannom izvijestio da metilensko modrilo ublažava bol kod neuralgičnih i reumatskih stanja mišića, zglobova i tetiva. Njih su dvojica raspravljala o tome bi li lijek mogao djelovati na psihičke bolesti i odlučila ga ne isprobati. Talijanski liječnik Pietro Bodoni iz Genove ipak je nastavio tim putem. Naslov njegova rada iz 1899 odnosi se na sedativno djelovanje kod različitih oblika psihoze: opisao je smirivanje četrnaest uznemirenih pacijenata i naveo da su drugi liječnici u Genovi već upotrebljavali bojilo u istu svrhu. Sedacija nije djelovanje na bolest, a ta se razlika u ovoj povijesti stalno iznova pojavljuje.

Rad na malariji uslijedio je 1891, s patologom Paulom Guttmannom, u bolnici Moabit u Berlinu. Metilensko modrilo dano je dvojici pacijenata, a izvješće je objavljeno u časopisu Berliner klinische Wochenschrift od 28. rujna 1891. U prvom slučaju pacijent je navečer 29. lipnja odjednom uzeo 0.5 g bojila; očekivani napadaj nije se u potpunosti razvio, a jedina naknadno zabilježena tegoba bila je blaga strangurija uz plavi urin. Napadaji vrućice nestali su tijekom prvih dana, a paraziti su nestali iz krvi najkasnije do osmog dana. Autori su saželi da su njihova očekivanja u potpunosti ispunjena. Dva slučaja bez kontrolne skupine nisu dokaz. Potpuniji prikaz metilenskog modrila i malarije, uključujući suvremena ispitivanja, pripada zasebnoj stranici, a ovdje je zanimljivo pitanje uže: koliko je Ehrlichova razmišljanja izdržalo susret s parazitom.

Gdje je obrazloženje opstalo, a gdje je zakazalo

Od predloženog mehanizma nije mnogo opstalo, barem ne u obliku koji je Ehrlich zamislio. Uredna verzija prema kojoj se plosnati triciklički kation umeće između parova baza parazitove DNA ne drži vodu kod roda Plasmodium. Inficirana crvena krvna stanica tako lako reducira metilensko modrilo da ono do parazita uopće ne stiže kao planarni kation, a objašnjenje interkalacijom koje odgovara akridinskim bojilima ne odgovara ovome.

Ono što dokazi podupiru manje je uredno. Metilensko modrilo inhibira parazitovu glutation-reduktazu pri koncentracijama koje se mogu postići u pacijentu. Blokira pretvorbu hema u hemozoin, inertni pigment koji parazit stvara kako bi izbjegao trovanje vlastitom razgradnjom hemoglobina, otprilike jednako učinkovito kao klorokin i mnogo učinkovitije od kinina. Njegovo redoks-kruženje također stvara reaktivne kisikove vrste u stanici koja ih već proizvodi. Još nije razjašnjeno koji je od tih mehanizama stvarno presudan, odnosno pridonose li svi.

Postoji i dodatna komplikacija, koja bi trebala oblikovati način na koji se čita svaka povijesna tvrdnja o ovom spoju. Komercijalno metilensko modrilo iz tog razdoblja nije bilo jedna tvar. Uzorci su sadržavali Azure B, monodemetilirani srodni spoj, a u starijim se otopinama nakupljalo više tog spoja. Azure B je metakromatsko bojilo s drukčijim ciljevima: dvolančanu DNA boji tamnoplavo, a RNA zeleno. Smjesa dvaju bojila koja odlaze na različita mjesta, u omjerima koje nitko nije bilježio, ne može biti temelj za jasnu tvrdnju o tome što je učinilo metilensko modrilo u njoj.

Samo bojilo nikada nije potisnulo kinin. Metoda je prošla bolje. Ehrlichov učenik Wilhelm Roehl, koji je radio za koncern bojila i lijekova IG Farben, nastavio je razvijati derivate bojila kao lijekove za tropske bolesti i osigurao alat koji je nedostajao: kanarinca zaraženog ptičjom malarijom kao rutinski model za probir kandidatskih spojeva. Werner Schulemann zatim je izmijenio bočni lanac, a dobivena fenotiazinijeva sol izliječila je eksperimentalnu infekciju. I dalje je pacijente činila plavima.

Pokazalo se da trajni rezultat nije ni bojilo ni prstenasti sustav, nego bočni lanac. Dodavanje dialkilaminoalkilamino skupine promijenilo je ponašanje molekule, a taj je fragment preživio svaku kasniju preinaku. Zadrži li se ta skupina i fenotiazinijev prsten zamijeni akridinskim, dobiva se kinakrin. Zamijeni li se kinolinskim, dobiva se klorokin. Pamakvin, primakvin i amodiakvin, koji su i dalje među antimalaricima, nose istu skupinu. Spoj koji nije uspio kao lijek dao je dio koji je uspio.

Veza s antipsihoticima vodi preko prstena, a ne preko lijeka. Razjašnjavanje strukture metilenskog modrila dovelo je Heinricha Augusta Bernthsena 1883 do osnovne fenotiazinske jezgre. Upravo su na tom kosturu, s različitim supstituentima, kemičari u Rhône-Poulencu radili tijekom 1940-ih u potrazi za antihistaminicima. Jedan od tih spojeva sintetiziran je potkraj 1950, a isprobao ga je kirurg Henri Laborit, koji je primijetio da pacijente ostavlja mirnima i ravnodušnima. Njegova prva objavljena primjena u psihijatriji, kod pacijenta s manijom, uslijedila je u siječnju 1952. Prvi antipsihotik nije toliko potomak Ehrlichova antimalarika koliko daleki rođak bojila od kojeg je krenuo.

Tri navike koje vrijedi zadržati iz ove epizode

1. „Prvi sintetski lijek primijenjen u medicini” opisuje kategoriju, a ograde su veće nego što izraz sugerira. Izraz se ustalio; često citirani pregledni rad Schirmera i suradnika u časopisu Neurobiology of Aging naziva metilensko modrilo prvim potpuno sintetskim lijekom primijenjenim u medicini. Kloral hidrat uveden je kao sintetski sedativ 1869, više od dvadeset godina ranije. Sam rad iz 1891 daje dio odgovora jer autori navode sintetske antipiretike koji su već bili neuspješni protiv malarije, među njima kinolin, antipirin i antifebrin. Ehrlichov vlastiti spoj arsena za sifilis pojavio se još kasnije. Obranjiva verzija tvrdnje odnosi se na metodu, a ne na prvenstvo: metilensko modrilo među najranijim je sintetskim spojevima odabranima za djelovanje protiv određenog organizma na temelju kemijske teorije selektivnosti.
2. Selektivna raspodjela nije selektivna korist. Ehrlichov rezultat iz 1886 bio je da bojilo odlazi u živčano tkivo. Kamo spoj odlazi i što čini kad onamo stigne dva su različita mjerenja, a prvo je mnogo lakše provesti. U tom su procjepu otad smještene većina tvrdnji o metilenskom modrilu i mozgu.
3. Čistoća pripada dokazima, a ne marketingu. Povijesni su zapisi nejednoznačni upravo zbog toga. Male strukturne razlike mijenjaju kamo ovaj spoj odlazi, pa certifikat analize mora biti vezan uz određenu seriju, a ne ponuđen kao opća tvrdnja da je proizvod ispitan. Prodavatelj koji tvrdi da proizvod odgovara farmakopejskoj monografiji, a ispituje samo teške metale, tvrdi više nego što izvješće podupire. Blupreme nabavlja metilensko modrilo od farmaceutskog proizvođača i ispituje cjelokupnu specifikaciju navedenu u monografiji: identitet, čistoću, organske nečistoće, ostatna otapala, elementarne nečistoće, ostatak nakon žarenja, mikrobiološke granice i bakterijske endotoksine. Izvješće je objavljeno uz proizvod, a stranica o metilenskom modrilu kvalitete USP objašnjava te granice i zašto prvo treba potražiti rezultat za Azure B.

Kronološki pregled izvora

Kronološki niz prekretnica, uključujući kemiju bojila prije Ehrlicha te razrede kvalitete i specifikacije nakon njega, zasebno je prikazan u povijesti metilenskog modrila, a identitet samog spoja obrađen je u članku o tome što je metilensko modrilo.

Ilustrativni prilozi na kojima se ovaj prikaz temelji, reproducirani u preglednom radu Krafts, Hempelmann i Skórska-Stania iz 2012, nisu jednakovrijedni, a jedan primjer pokazuje zašto. Prilog iz 1891 primarni je zapis ispitivanja; portret iz 1910 pokraj njega vremenski smješta ugled i ništa više. Stranice iz Andersagove bilježnice iz 1934 izravan su trag kinolinske supstitucije, pisan rukom samog kemičara.

Pošten sažetak Ehrlichovih pokusa s bojilima jest da je pogodio selektivnost i cilj, a promašio mehanizam. Metilensko modrilo doista se koncentrira u živčanom tkivu i doista šteti parazitu malarije. Drugo ne čini zbog prvoga, a kemijsko objašnjenje koje je ponudio za oboje bilo je pogrešno. Ono što je nedvojbeno pokazao bilo je trajnije od točnog mehanizma: spoj se može odabrati, a ne samo pronaći, i to na temelju dokaza prikupljenih prije nego što ga itko dade pacijentu.