Kako metilensko modrilo ulazi u stanice: redukcija, reoksidacija i raspodjela u membrani

Promatrate li kako endotelne stanice u posudici unose metilensko modrilo, najočitije je tumačenje ujedno i pogrešno. Medij gubi plavu boju, a u stanicama se pojavljuju plave granule, pa se čini da je bojilo moralo proći kroz membranu kao plava molekula. Pokusi govore drukčije. Plavi oblik jedva prolazi kroz membranu. Prolazi bezbojni oblik, a plava boja koju vidite unutra nastaje unutar stanice, nakon ulaska.

Taj obrat važan je jer određuje što obojenje može, a što ne može pokazati. Plave granule upućuju na oksidirano bojilo koje je ponovno oksidirano i zadržano u organelima. One ne pokazuju ukupnu količinu bojila u stanici, ne pokazuju njegov reducirani dio i ne mjere biološki učinak. Da biste razumjeli zašto, pratite tri koraka: redukciju na površini, difuziju reduciranog oblika te reoksidaciju i zadržavanje unutar stanice.

Dva se oblika ponašaju kao različite molekule

Oksidirano metilensko modrilo plosnat je, pozitivno nabijen prstenasti sustav. Otapa se u vodi, snažno apsorbira svjetlost na valnim duljinama oko 600 do 700 nanometara i izgleda plavo. Ključan je naboj. Nabijena hidrofilna molekula ne prolazi lako kroz lipidnu membranu, pa se u literaturi pažljivo opisuje kao relativno slabo permeantna kroz membranu, a ne kao nepermeantna.

Reducirano metilensko modrilo, nazvano leukometilensko modrilo, bezbojno je, nenabijeno i topljivo u mastima. Uklonite naboj i membrana prestaje biti zid. Reducirana molekula lako difundira kroz nju, a nakon ulaska u odjeljak s jačim oksidacijskim uvjetima može ponovno izgubiti elektrone i vratiti se u plavi, nabijeni oblik koji ostaje zadržan. Redoks-kemija bojila stoga je ujedno i njegov mehanizam prijenosa. Promijenite broj elektrona i mijenjate permeabilnost.

Elektroni za prvi korak dolaze iz same stanice. Stanice sisavaca provode prijenos elektrona kroz plazmatsku membranu, prenoseći redukcijske ekvivalente od unutarstaničnih donora prema van, do akceptora na površini. Ta aktivnost prijenosa kroz plazmatsku membranu normalna je stanična funkcija prisutna u većini tipova stanica, a reduktaza na površini endotela koja djeluje na tiazinska bojila u jednom se važnom pogledu ponaša poput drugih: nastavlja raditi u prisutnosti cijanida i azida u dozama koje zaustavljaju kasnije korake. To razdvajanje ključno je za cijelu priču.

Raspodjela između faza bila je prvo objašnjenje i gotovo je objasnila unos

Godine 1929. Marian Irwin s Instituta Rockefeller postavila je jednostavnije pitanje. Možda je ulazak bojila tek raspodjela između vode i masnih slojeva stanice, a sloj kloroforma može u laboratoriju poslužiti kao zamjena za te masne slojeve. U svojim spektrofotometrijskim istraživanjima prodiranja protresala je vodene otopine bojila s kloroformom i uspoređivala ono što je prelazilo u organsku fazu s onim što je ulazilo u žive stanice algi.

Dva nalaza iz tog rada i dalje zaslužuju pozornost. Prvo, komercijalne otopine metilenskog modrila sadržavale su trimetiltionin, danas nazvan Azure B, a ta je nečistoća prodirala brže od samog metilenskog modrila, osobito pri alkalnom pH, kada prevladava oblik slobodne baze topljiv u lipidima. Dio prividnog ulaska metilenskog modrila zapravo je bio selektivan ulazak bojila Azure B. Drugo, pH je određivao ishod određujući ionizacijsko stanje, a oštećene stanice propuštale su mnogo više bojila od neoštećenih. Koeficijenti raspodjele i stanje naboja određivali su što apsorbiraju umjetni sustav i živa stanica, a sličnost između njih podupirala je zamisao o nevodenim slojevima na staničnoj granici.

Model je bio dalekovidan u pogledu lipida i ionizacije, ali nije mogao razlikovati bojilo koje se raspodjeljuje u vlastitom obliku od bojila koje se kemijski pretvara na površini, prelazi membranu u izmijenjenom obliku i unutar stanice vraća u početni oblik. Za tu je razliku bio potreban drukčiji pokus, a on je uslijedio sedamdeset godina poslije na plućnom endotelu.

Redukcija izvana, zadržavanje iznutra

Merker i suradnici radili su s uzgojenim endotelnim stanicama goveđe plućne arterije i predložili slijed od tri koraka: oksidirano bojilo na staničnoj se površini reducira u svoj bezbojni lipofilni oblik, reducirani oblik difundira unutra, a unutarstanična reoksidacija obnavlja oksidirani oblik koji ne prolazi kroz membranu i zato se nakuplja. Njihovo istraživanje unosa tiazinskih bojila u endotelne stanice zatim je provjerilo taj slijed pokušavajući ga prekinuti na određenim mjestima.

Prvo sredstvo bio je fericijanid, akceptor elektrona koji ne može ući u stanicu. Kada površinski enzimi izvan stanice reduciraju plavo bojilo u njegov bezbojni oblik, fericijanid može preuzeti te elektrone i ponovno stvoriti plavo bojilo u mediju prije nego što ono uopće prijeđe membranu. Dok god je fericijanid bio prisutan u suvišku (10 mikromolarnog bojila naspram 50 do 500 mikromolarnog fericijanida), unos bojila gotovo je prestajao, a tek nakon što bi se fericijanid potrošio unos bi se nastavio uobičajenom brzinom. Kinetika je isto pokazala na drugi način. Fericijanid je nestajao približno konstantnom brzinom, u skladu sa stalnim tokom površinske redukcije koji opskrbljuje posrednik sposoban za kruženje, dok je izvanstanično bojilo nestajalo eksponencijalno kako se njegova zaliha smanjivala. Konstantan tok uz smanjivanje zalihe znači da signal fericijanida pokazuje kontinuiranu redukciju, a ne izlazak molekula bojila iz otopine.

Drugo sredstvo potpuno je uklonilo korak prolaska kroz membranu. Skupina je toluidinsko modrilo O, blisko srodno tiazinsko bojilo, vezala na velik poliakrilamidni lanac, prevelik da bi ušao u stanicu u bilo kojem oksidacijskom stanju. Stanice su i dalje reducirale vezano bojilo. Redukcija stoga ne zahtijeva pristup unutrašnjosti stanice. Mehanizam je izložen na površini ili je s njom električno povezan.

Zatim je uslijedilo razdvajanje procesa po kojem je rad dobio naslov. Cijanid i azid pri 2 milimolara snažno su suzbili nakupljanje bojila, a pod mikroskopom su tamnoplave i ljubičaste inkluzije koje obično okružuju jezgru gotovo nestale. Ipak, nijedan inhibitor nije usporio izvanstaničnu redukciju: ciklus fericijanida nastavio se nesmanjeno, a polimer koji ne prolazi kroz membranu i dalje se reducirao. Blokada je bila u kasnijem koraku. Cijanid i azid zaustavljali su unutarstaničnu reoksidaciju i sekvestraciju, a ne površinsku redukciju. Kontrolni testovi vijabilnosti poduprli su to tumačenje jer su stanice tijekom tih postupaka zadržale svoj citosolni bilježni enzim laktat-dehidrogenazu, pa gubitak unosa nije bio samo posljedica trovanja ili pucanja membrane.

Jedna napomena iz rada i dalje vrijedi. Plave inkluzije nalazile su se oko jezgre, ali ne u njoj, što je u skladu s oksidacijom unutar subcelularnih organela, no istraživanje nije utvrdilo o kojim je organelima riječ. Slični obrasci u drugim tipovima stanica nazivali su se lizosomskima na temelju oskudnih dokaza. Zadržavanje smatrajte utvrđenim, a njegovu lokaciju zasad pretpostavljenom. Čitatelji koji prate kamo elektroni odlaze dalje mogu nastaviti s temom mitohondrijskog prijenosa elektrona i redoks-procesa te širom slikom apsorpcije i raspodjele prema putu primjene.

Obojenje nije izloženost

Treće istraživanje pokazuje što se događa kada se ta logika unosa usporedi s biološkim pokazateljem. Scott i suradnici utvrdili su da metil-beta-ciklodekstrin, šećerna molekula u obliku prstenastog torusa, izravno veže metilensko modrilo, uz konstantu asocijacije od oko 310 po molaru za inkluzijski kompleks, naspram oko 5846 po molaru za dimerizaciju bojila. U fibroblastima L929 to je vezanje blokiralo i stanično obojenje i stimulaciju unosa glukoze: predinkubacija s ciklodekstrinom spriječila je plavo obojenje, a njegovo naknadno dodavanje ubrzalo je odbojavanje. Kako je optički signal plave boje nestajao iz stanica, aktivirani prijenos glukoze slabljeo je usporedno s njim.

Autori su tu korelaciju protumačili kao nalaz koji više podupire izravnu interakciju bojila s proteinom u putu aktivacije prijenosnika glukoze nego dugotrajan mehanizam oksidacijskog stresa. Taj je zaključak razuman, ali ograničen. Pokus ne identificira protein, ne pokazuje vezanje za sam prijenosnik, a korelacija između odbojavanja i gubitka učinka ne može isključiti svaki put posredovan redoks-procesima.

Trajna je pouka vezana uz mjerenje. Optičko obojenje pokazuje vidljivo, oksidirano bojilo povezano sa stanicom. Ono potpuno propušta bezbojni reducirani dio, pa blijeda stanica i dalje može sadržavati ekvivalente bojila, dok intenzivno obojena stanica pokazuje zadržano oksidirano bojilo, a ne ukupnu izloženost tkiva ili veličinu učinka. Isti oprez vrijedi i na većoj razini: uspoređivanje obojenja među tipovima stanica ili tumačenje tamnog tkivnog reza kao dokaza veće izloženosti ponavlja početnu pogrešku iz posudice. Unos je ciklus redukcije, difuzije i reoksidacije, a svaki pojedinačni snimak plavog oblika prikazuje samo jedan njegov dio. Iz toga izravno proizlaze praktične posljedice za laboratorijsko bojenje i rukovanje te za tumačenje tvrdnji o dozi i izloženosti.