Metilensko modrilo i crijevni mikrobiom: dokazi iz istraživanja na miševima

Metilensko modrilo može promijeniti bakterijski profil izmjeren u izmetu miševa. Taj nalaz ne dokazuje da poboljšava zdravlje crijeva u ljudi, selektivno uklanja štetne bakterije ili liječi disbiozu. Ključna je razlika između mijenjanja mikrobne zajednice i poboljšanja zdravlja njezina domaćina.

Pokus na miševima koji je najizravnije povezan s tim pitanjem mjerio je bakterijsku DNA i uspješnost u labirintu. Ta mjerenja mogu otkriti obrasce koje vrijedi istražiti. Sama po sebi ne mogu dokazati da je promjena bakterija uzrokovala promjenu ponašanja ili da bilo koja od tih promjena predviđa ublažavanje probavnih simptoma.

Što su istraživači zapravo mjerili

U pokusu Gureeva i suradnika iz 2020. godine, tromjesečni miševi C57Bl/6 tijekom četiri tjedna primali su metilensko modrilo u dozi od 15 mg/kg/day (devet miševa), 50 mg/kg/day (osam) ili kontrolnu vodu (13). Odjeljak o nacrtu pokusa ne navodi jasno put primjene lijeka ni spol životinja.

Uzorci izmeta uzimani su prije tretmana i zatim tjedno. Istraživači su koristili qPCR za bakterijske skupine i dodatno sekvenciranje amplikona 16S DNA. Tijekom posljednjih pet dana miševi su prošli dva dana privikavanja, a zatim tri dana testiranja u T-labirintu uz nagrađivanje, s deset bodovanih odabira dnevno.

To su eksperimentalne izloženosti miševa, a ne preporuke za doziranje u ljudi. Put primjene važan je za tumačenje količine lijeka koja dospijeva u crijeva, a put koji nije naveden treba ostati nenaveden. Preračunavanje prema tjelesnoj masi ne bi dokazalo siguran ili učinkovit režim primjene u ljudi.

Tablica dokaza iz istraživanja mikrobioma

Ova izvorna tablica razdvaja zabilježena opažanja od dodatnih tvrdnji na koje čitatelj može naići. Nazivi bakterijskih skupina slijede terminologiju rada.

Razina dokaza	Opažanje ili mjerenje	Granica tumačenja
Bakterijski profil pri nižoj izloženosti	Pri 15 mg/kg/day promijenile su se odabrane skupine; Delta/Gammaproteobacteria porasle su rano, a u četvrtom tjednu nisu bile detektirane.	Uzorak uzet na kraju može propustiti ranije promjene. Nedetektiranje ovisi o metodi analize.
Bakterijski profil pri višoj izloženosti	Pri 50 mg/kg/day medijan udjela skupine Proteobacteria u četvrtom tjednu iznosio je 7.49%, u usporedbi s 1.61% u kontrolnoj skupini.	Povećanje postotka ne dokazuje apsolutno povećanje broja živih stanica.
Taksonomski detalji	Sekvenciranje je otkrilo promjene unutar širokih bakterijskih skupina.	Stabilna ukupna zastupljenost koljena može prikriti promjene među njegovim pripadnicima.
Ponašanje domaćina	Niža izloženost poboljšala je objedinjene rezultate u T-labirintu; viša izloženost nije.	To je uspješnost u određenom zadatku, a ne sveobuhvatna procjena kognitivnih sposobnosti.
Povezanost	Deferribacteres su bile negativno povezane s rezultatima drugog dana.	Korelacija ne otkriva uzročni organizam ili mehanizam.
Funkcija crijeva	Nije izravno mjeren nijedan ishod povezan s crijevnom barijerom ili metabolitima.	Istraživanje ne može dokazati normalizaciju propusnosti ili poboljšanje mikrobne funkcije.
Ispitivanje uzročnosti	Nije proveden pokus prijenosa ili smanjenja mikrobiote.	Ostaje nerazjašnjeno jesu li mikrobi posredovali u učinku na ponašanje.

Tablica je namjerno podijeljena prema onome što je izmjereno. Povoljan odgovor u jednom retku ne može nadomjestiti odgovor koji nedostaje u drugom. Primjerice, bolja uspješnost u labirintu ne pruža dokaze koji nedostaju o upali crijeva.

Zašto postotci bakterija ne pokazuju što je ubijeno

Pojam relativna zastupljenost opisuje udio skupine u izmjerenoj zajednici. To se razlikuje od broja bakterijskih stanica po gramu stolice. U svojem istraživanju kvantitativnog profiliranja mikrobioma Vandeputte i suradnici pokazali su zašto je mikrobno opterećenje važno pri tumačenju razlika među zajednicama.

Razmotrite ilustrativni uzorak koji sadrži deset jedinica organizma A i 90 jedinica drugih organizama. A čini 10%. Ako A ostane na deset, a ostali padnu na 40, A sada čini 20%. Njegov se udio udvostručio bez ikakva povećanja njegove apsolutne količine. Ovaj aritmetički primjer nije rezultat pokusa s metilenskim modrilom.

Ista razlika ograničava tvrdnje o ubijanju bakterija. Udio utvrđen na temelju DNA nije izravan test preživljavanja. Da bi dokazao gubitak živih bakterija, pokus treba mjerenja koja ispituju njihovu vijabilnost i uzimaju u obzir ukupnu populaciju. Da bi dokazao funkcionalnu promjenu, treba relevantno funkcionalno mjerenje, poput izmjerenog metabolita, a ne predviđanja temeljenog samo na nazivima bakterija.

Široke oznake također prikrivaju biološku raznolikost. Smatrati cijelo koljeno korisnim ili štetnim znači zanemariti organizme i aktivnosti odgovorne za određeni ishod. Promjena omjera stoga sama po sebi nije dijagnoza disbioze niti dokaz da je disbioza izliječena.

Je li mikrobiom objasnio rezultat u labirintu?

Pokus je obuhvatio izloženost lijeku, bakterijski profil i ponašanje u istom istraživanju. To je korisno za postavljanje hipoteze. Prema našem tumačenju, nacrt istraživanja ne omogućuje razlikovanje nekoliko mogućih objašnjenja: izravnog učinka lijeka na ponašanje, neizravnog mikrobnog učinka ili zasebnih odgovora ponašanja i bakterija na istu izloženost.

Uvjerljiviji pokus za ispitivanje posredovanja mijenjao bi pretpostavljenog mikrobnog posrednika neovisno o lijeku. Istraživači bi mogli ispitati prenosi li se učinak prijenosom definirane zajednice ili sprječava li ga uklanjanje pretpostavljenog mikrobnog puta. Takvi pokusi zahtijevaju i kontrole za ono što se još prenosi ili mijenja.

Ishod povezan s ponašanjem zahtijeva jednako pažljivo tumačenje. Labirint s nagrađivanjem traži od životinje da donosi odluke u određenim uvjetima. Pri procjeni treba imati na umu da uspješnost može ovisiti o spremnosti na istraživanje, kretanju, motivaciji za nagradu i učenju. Nazivanje rezultata „boljim kognitivnim sposobnostima” zanemaruje te razlike. Opis izravno mjerenog zadatka i dalje pruža više informacija.

Ubija li metilensko modrilo crijevne bakterije?

Metilensko modrilo može sudjelovati u antimikrobnom djelovanju u definiranim laboratorijskim uvjetima. To ne određuje što se događa s cijelom crijevnom zajednicom nakon oralne primjene.

Primjerice, laboratorijsko istraživanje fotodinamičke inaktivacije bakterija ispitivalo je E. coli i S. aureus uz fotosenzibilizatore i kontrolirano osvjetljavanje. Procjenjivalo je stvaranje kolonija i oštećenje membrane te uključivalo odgovarajuće kontrole u mraku. Samo svjetlo ili samo fotosenzibilizator nisu imali učinak u tim ispitivanim uvjetima.

Te kontrole odgovaraju na važno pitanje o uzročnosti unutar tog pokusa: kakav je bio doprinos kombinacije? Gutanje tvari ne reproducira osvjetljavanje bakterijske suspenzije. S druge strane, negativan rezultat kontrole u mraku pri jednoj koncentraciji i trajanju ne dokazuje da je svaka izloženost bez osvjetljavanja biološki neaktivna. Pregled antimikrobnih istraživanja objašnjava te razlike koje ovise o uvjetima.

Istraživanje crijevne zajednice također ne može dokazati liječenje određene infekcije. Identifikacija organizma i dokazivanje odgovarajućeg kliničkog ishoda zasebni su zadaci, uključujući pri procjeni tvrdnji o liječenju parazita.

Što to znači za tvrdnje o zdravlju crijeva u ljudi

Ciljana pretraga literature za ovaj članak nije pronašla kontrolirano istraživanje crijevnog mikrobioma u ljudi koje bi dokazalo korist metilenskog modrila za zdravlje crijeva. To je tvrdnja o pronađenim dokazima, a ne dokaz da ne postoji nijedno relevantno istraživanje. Istraživanja lokalnog fotodinamičkog liječenja usne šupljine u ljudi bave se drugim pitanjem: primjerice, ispitivanje halitoze na 45 osoba uzorkovalo je naslage na jeziku i mjerilo plinove u dahu, a ne zdravlje crijeva.

Kako bi potkrijepilo tvrdnju o zdravlju crijeva u ljudi, istraživanje bi trebalo imati definiranu populaciju, reproducibilnu formulaciju i put primjene, odgovarajuću usporedbu te ishod važan toj populaciji. Mikrobni profil mogao bi pomoći objasniti rezultat, ali i dalje bi trebalo procijeniti poboljšanje simptoma, kontrolu bolesti i štetne učinke.

Četiri tjedna u jednom mišjem modelu također ne mogu dokazati posljedice višemjesečne ili višegodišnje primjene. Pregled svakodnevne i dugotrajne izloženosti metilenskom modrilu razdvaja trajanje tretmana od razdoblja praćenja i sigurnosnih ishoda. Za širi klinički kontekst pogledajte što podupiru istraživanja na ljudima.