Bojenje metilenskim modrilom: mikroskopske metode i atlas stvarnih snimaka

Bojenje metilenskim modrilom olakšava razlikovanje inače slabo vidljivih staničnih obilježja u mikroskopiji svijetlog polja. Može pomoći učenicima da pronađu jezgru stanice sluznice obraza ili prouče obrise i raspored mikroorganizama. No plavi objekt samo je opažanje. Imenovanje organizma, njegovo mjerenje i procjena upućuje li na bolest zasebni su zadaci.

Naslovna slika prikazuje načelo kontrasta. Atlas u nastavku sadrži stvarne fotografije neovisno dokumentiranih uzoraka, s izvornim podacima o njihovim izvorima.

Što metilensko modrilo otkriva?

Metilensko modrilo je bazično bojilo: njegov obojeni ion nosi pozitivan naboj. Kako OpenStax objašnjava u prikazu bojenja uzoraka, bazična bojila stupaju u interakciju s negativno nabijenim staničnim materijalom i mogu istaknuti stanice na svjetlijoj pozadini. U prikladnim preparatima metilensko modrilo ističe područja bogata nukleinskim kiselinama i druge strukture koje vežu bojilo.

Pri jednostavnom bojenju jedno bojilo stvara kontrast. Zbog toga različiti organizmi mogu izgledati plavo iako nisu isti organizam. Korisna su pitanja u početku opisna: jesu li objekti okrugli ili izduženi, izdvojeni ili grupirani, jednoliko obojeni ili s vidljivim unutarnjim razlikama? Pogledajte razliku između jednostavnog bojenja i bojenja po Gramu prije nego što boju protumačite kao rezultat klasifikacije.

Kontrast i razlučivost nisu isto. Kontrast pomaže razlikovati objekt od njegove okoline; razlučivost omogućuje razdvajanje bliskih detalja. Tamnija slika ne jamči više razlučenih struktura. Ni svaku tamnu granulu ne treba označiti kao organelu.

Nativni preparati, obojeni vlažni preparati i razmazi

Neobojeni, odnosno nativni, vlažni preparat omogućuje promatranje bez dodanog bojila, iako izdvajanje iz izvornog okoliša ipak mijenja uzorak. U obojenom vlažnom preparatu dodaje se reagens dok materijal ostaje u tekućini ispod pokrovnog stakalca. Za fiksirani razmaz materijal se razmazuje na predmetnom stakalcu i primjenjuje se određena metoda fiksacije prije daljnje obrade. OpenStaxov pregled pripreme razlikuje vlažne preparate od fiksacije i objašnjava zašto fiksirani organizmi više ne omogućuju promatranje normalnog kretanja ili metabolizma.

Ti preparati odgovaraju na različita pitanja:

Za usporedbu u nastavi zabilježite neobojeni preparat prije promatranja zasebno obojenog preparata izrađenog prema nastavnom protokolu. Održavajte usporedive uvjete osvjetljenja i postavke snimanja. Ako su fotografirane dvije različite stanice, opišite ih kao primjere, a ne kao prikaz jedne stanice prije i poslije bojenja.

Mikroskopski atlas: tri stvarna obojena uzorka

Ovaj atlas predstavlja izvorni odabir i tumačenje triju mikrografija objavljenih pod otvorenim licencama. Autori izvora navode uzorke i bojila. Nismo neovisno potvrdili identitet njihovih uzoraka. Slike su reproducirane bez obrezivanja, pretvorene u WebP bez gubitaka, bez dodanih obilježja ili promjena boje.

Tabla 1: stanice ljudske sluznice obraza

Uzorak: stanice ljudske sluznice obraza. Bojilo: metilensko modrilo. Povećanje: 400×, prema navodu fotografa. Mjerna traka: nije dostupna; izvor ne navodi kalibriranu veličinu piksela. Fotografija autora Fritzmann2002, 2017, iz izvora Stanice ljudske sluznice obraza (bojenje metilenskim modrilom), pod licencom CC BY-SA 4.0. Ova reprodukcija zadržava tu licencu.

Počnite s izdvojenom stanicom: njezinu tamniju jezgru lakše je razlikovati od okolne plave citoplazme. Zatim pregledajte stanice koje se preklapaju ispod nje. Preklapanje otežava praćenje granice i može stvoriti lokalno tamnije područje. Koristite ovu tablu za vježbanje praćenja obrisa, a ne za brojanje svake tamne mrlje kao jezgre. Vodič za promatranje stanica sluznice obraza detaljnije obrađuje vježbu za taj uzorak.

Tabla 2: stanice luka

Uzorak: stanice luka, prema identifikaciji u izvoru. Bojilo: metilensko modrilo. Povećanje: “200x” pojavljuje se u izvornom nazivu datoteke; nije neovisno potvrđeno. Mjerna traka: nije dostupna; kalibracija nije navedena. Fotografija autora Alvy16, 2019, iz izvora Stanica luka 200x, pod licencom CC BY 4.0.

Izduženi odjeljci tvore organiziran sloj. Usporedite njihove duge zajedničke granice s nepravilnim obrisima na Tabli 1. Uočite i izrazit tamni materijal te neujednačenu svjetlinu vidnog polja. Fotografija ne utvrđuje identitet svake tamne naslage. Pokazuje zašto koristan zapis opažanja uključuje artefakte i nesigurnost umjesto da označava sve što se oboji.

Tabla 3: kvasac koji je izvor identificirao kao Candida spp.

Uzorak: Candida spp., prema navodu fotografkinje. Bojilo: jednostavno pozitivno bojenje metilenskim modrilom. Povećanje: nije dostupno. Mjerna traka: nije dostupna; kalibrirana veličina piksela nije navedena. Fotografija Marte, korisnice Wikimedije Martunia.g, 2021, iz izvora Pozitivno bojenje metilenskim modrilom 2, pod licencom CC BY 4.0.

Usporedite guste plave nakupine s manje zbijenim rubnim područjima. Pojedinačne obrise lakše je pratiti ondje gdje se objekti manje preklapaju. Naziv Candida potječe iz zapisa izvora, a ne iz identifikacije vrste provedene na ovoj fotografiji. Ova tabla također ne daje rezultat procjene vijabilnosti. Testovi vijabilnosti i respiracije kvasca zahtijevaju vlastite uvjete, kontrole i tumačenje.

Ispravno čitanje mjerila

Ove table omogućuju vizualnu usporedbu, a ne mjerenja u mikrometrima ili usporedbe apsolutne veličine stanica između tabli. Navedeno povećanje ne može nadomjestiti nedostajuću kalibraciju kamere. Promjena veličine prikaza slike mijenja njezino prividno povećanje.

Za vlastite slike uspostavite mjernu kalibraciju pomoću poznatog etalona i odgovarajuće optičke konfiguracije. Nikonov vodič za mikrometriju objašnjava kako objektni mikrometar pretvara proizvoljne podjele na slici ili mjernoj mrežici u fizičke duljine. Zabilježite objektiv, konfiguraciju kamere i kalibraciju te na temelju tih podataka dodajte mjernu traku. Nemojte je izvoditi iz prosječne veličine stanice navedene u udžbeniku.

Odgovara li sadržaj bočice metodi?

Bočica s oznakom metilensko modrilo nije potpuna laboratorijska specifikacija. Provjerite koncentraciju i jedinice, otapalo, dodatne sastojke, predviđenu primjenu, dokumentaciju serije i upute. Sigurnosno-tehnički list reagensa opisuje opasnosti; upute za metodu određuju kako ga koristiti za predviđeni preparat.

Konkretan primjer je Merckova Löfflerova otopina metilenskog modrila. Proizvođač je označava kao reagens za mikroskopiju i opisuje njezinu ulogu kao kontrastnog bojila pri bojenju acidorezistentnih mikroorganizama. Navedena zapaljivost također pokazuje zašto opis “plava tekućina” nije dovoljan za planiranje rukovanja ili zagrijavanja. Ta svojstva vrijede za tu formulaciju, a ne automatski za svaku vodenu otopinu metilenskog modrila.

Isto tako, eozin-metilensko modrilo agar formulirana je hranjiva podloga. Nije bojilo za mikroskopske preparate koje se dobiva dodavanjem samog metilenskog modrila uzorku. Za drukčiji cilj mikroskopskog prikaza usporedite alternative metilenskom modrilu za mikroskopiju.

Pri radu s početničkim mikroskopskim kompletom krenite od njegove dokumentirane nastavne metode, poznatih gotovih preparata i propisanog reagensa. Ako je bočica izgubila oznaku ili se njezin sastav ne može utvrditi, zamijenite je odgovarajućim dokumentiranim reagensom. Koristite zaštitu za oči i slijedite upute za rukovanje dostavljene za konkretnu formulaciju. Ljudski materijal i nepoznati uzorci iz okoliša zahtijevaju postupke nastavnog laboratorija za rukovanje uzorcima i njihovo zbrinjavanje; bojenje nije zamjena za te postupke.

Zapišite opažanje prije zaključka

“Plavi ovalni objekti u nakupinama” opravdan je opis slike. “Određena infekcija” zahtijeva dokaze koje slika nije pružila. U bilježnici odvojeno bilježite podrijetlo uzorka, pripremu, reakciju bojenja i metodu identifikacije. Ta razlika čini jednostavnu nastavnu sliku korisnom i sprječava da se privlačnoj mikrografiji pripiše tvrdnja koju ne može potkrijepiti.