मेथिलीन ब्लू और सूजन-संबंधी संकेतन: इन्फ्लामासोम, IL-6 और STAT3

मान लें कि तीन प्रयोगशालाएँ बताती हैं कि एक ही नीला यौगिक सूजन-रोधी है। एक मैक्रोफेज से कम IL-1beta निकलना दिखाती है। दूसरी उसी प्रकार की कोशिका में कम iNOS एंजाइम दिखाती है। तीसरी रक्त में कम IL-6 और मस्तिष्क में कम STAT3 गतिविधि दिखाती है। इन तीनों को एक ही दावे में मिलाने का प्रलोभन हो सकता है। लेकिन ऐसा करने से वास्तविक निष्कर्ष छिप जाता है।

हर परिणाम संकेतन की एक अलग अवधारणा से जुड़ा है, जिसका अपना उद्दीपक, संयोजन चरण और मापनीय परिणाम है। मेथिलीन ब्लू इनमें से प्रत्येक को एक अलग बिंदु पर प्रभावित करता है। इनमें से कोई भी प्रभाव स्वास्थ्य परिणाम में सुधार करता है या नहीं, यह एक अलग प्रश्न है, जिसकी चर्चा हमारे मेथिलीन ब्लू और सूजन के अवलोकन में की गई है। यह पृष्ठ केवल संकेतन मार्गों पर केंद्रित है।

मार्ग 1: इन्फ्लामासोम का संयोजन और कैस्पेस-1

इन्फ्लामासोम एक प्रोटीन ढाँचा है जो आवश्यकता पड़ने पर मायलॉइड कोशिका के भीतर बनता है। इसके घटक एक सेंसर, ASC नामक एक अडैप्टर और कैस्पेस-1 नामक एक प्रभावकारी एंजाइम हैं। संयोजन पूरा होने के बाद कैस्पेस-1, pro-IL-1beta और pro-IL-18 को काटकर उनके स्रावित होने वाले रूप बनाता है और पायरोप्टोसिस को शुरू कर सकता है, जो कोशिका मृत्यु का एक सूजनकारी रूप है। सेंसर इसका प्रकार निर्धारित करता है: NLRP3 क्रिस्टलों और नाइजेरिसिन तथा ATP जैसे छिद्र बनाने वाले विषाक्त पदार्थों के प्रति प्रतिक्रिया देता है, NLRC4 जीवाणु फ्लैजेलिन के प्रति, AIM2 कोशिकाद्रव्य में मौजूद द्विसूत्री DNA के प्रति और गैर-कैनोनिकल मार्ग अंतःकोशिकीय लिपोपॉलीसैकराइड के प्रति प्रतिक्रिया देता है।

सक्रियण के लिए दो संकेत आवश्यक हैं। पहला संकेत प्राइमिंग है: टोल-जैसे रिसेप्टर का एक लिगैंड, NLRP3 और pro-IL-1beta का NF-kB-निर्भर प्रतिलेखन कराता है, ताकि आवश्यक घटक मौजूद हों। दूसरा संकेत संयोजन है: एक दूसरा उद्दीपक ASC को ओलिगोमर बनाकर बिंदुनुमा समूहों में इकट्ठा करता है, कैस्पेस-1 को काटकर उसका p20 खंड बनाता है और परिपक्व IL-1beta p17 को मुक्त कराता है। माइटोकॉन्ड्रिया की प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियाँ और क्रिस्टलों का अंतर्ग्रहण, NLRP3 के दूसरे संकेत में योगदान देने वाले ज्ञात कारक हैं।

इन्फ्लामासोम के व्यापक अवरोधन पर 2017 के मैक्रोफेज अध्ययन ने दोनों संकेतों पर मेथिलीन ब्लू का परीक्षण किया। लिपोपॉलीसैकराइड से प्राइम किए गए चूहों के अस्थि-मज्जा मैक्रोफेज में नाइजेरिसिन, ATP और मोनोसोडियम यूरेट क्रिस्टलों में से प्रत्येक ने IL-1beta और कैस्पेस-1 की मुक्ति के साथ ASC के बिंदुनुमा समूहों का निर्माण प्रेरित किया। 20 से 200 micromolar मेथिलीन ब्लू ने कोशिकाओं को मारे बिना, खुराक-निर्भर तरीके से इन तीनों को कम किया। NLRC4 के लिए फ्लैजेलिन और साल्मोनेला, AIM2 के लिए द्विसूत्री DNA और लिस्टेरिया तथा गैर-कैनोनिकल मार्ग के लिए ट्रांसफेक्ट किया गया लिपोपॉलीसैकराइड या जीवित E. coli ने भी यही पैटर्न दिखाया। अकेले इस यौगिक ने मुक्ति शुरू नहीं की और नियंत्रण प्लेटों पर कोई जीवाणुरोधी प्रभाव नहीं दिखा, इसलिए परिणाम मेज़बान की प्रतिक्रिया से संबंधित है।

मार्ग के पहले के चरणों में तीन हस्तक्षेपों को मापा गया। रोटेनोन से प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल सुपरऑक्साइड मेथिलीन ब्लू के साथ घटा और उसके साथ रोटेनोन से प्रेरित IL-1beta की मुक्ति भी घटी। फ्लोरोसेंट मोतियों का अंतर्ग्रहण घटा, जो क्रिस्टलों की पहचान से पहले फागोसाइटोसिस में कमी के अनुरूप है। दो NF-kB स्थलों वाले NLRP3 प्रमोटर से संचालित रिपोर्टर ने मेथिलीन ब्लू के साथ कम गतिविधि दिखाई, जबकि उन स्थलों के बिना वाले छोटे किए गए प्रमोटर ने प्रतिक्रिया नहीं दी। कोशिका-रहित परखनली में मेथिलीन ब्लू ने पुनःसंयोजक मानव कैस्पेस-1 की गतिविधि भी सीधे घटाई। यौगिक को केवल प्राइमिंग के समय या केवल सक्रियण के समय जोड़ने पर भी IL-1beta, IL-18 और कैस्पेस-1 की मुक्ति कम हुई, इसलिए दोनों चरण इसमें शामिल हैं।

चूहों पर किए गए परीक्षणों में भी यही चयनात्मकता दिखी। लिपोपॉलीसैकराइड की घातक खुराक ने नियंत्रण समूह के चूहों को कुछ घंटों में मार दिया, जबकि मेथिलीन ब्लू ने जीवित रहने की दर में सुधार किया; पेरिटोनियल द्रव में IL-1beta घटा, लेकिन उसी द्रव में IL-6 नहीं घटा। लिस्टेरिया पेरिटोनाइटिस मॉडल में पेरिटोनियल IL-1beta घटा, जबकि कुल कोशिका संख्या अपरिवर्तित रही। मानव THP-1 मोनोसाइट ने सभी चार प्रकार के इन्फ्लामासोम में चूहों के मैक्रोफेज जैसा व्यवहार दिखाया। इन्फ्लामासोम का परिणाम IL-1beta और IL-18 की परिपक्वता को समझाता है, हर साइटोकाइन को नहीं। इसी कारण माइक्रोग्लिया और एस्ट्रोसाइट प्रयोगों में मस्तिष्क की प्रतिरक्षा कोशिकाओं का आकार, प्रोटीन ढाँचे के संयोजन से अलग प्रश्न का उत्तर देता है।

मार्ग 2: NF-kB और STAT1 के बंधन के माध्यम से iNOS प्रतिलेखन

इंड्यूसिबल नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़, या iNOS, विश्राम अवस्था में बहुत कम मौजूद होता है और आवश्यकता पड़ने पर इसका प्रतिलेखन होता है। लिपोपॉलीसैकराइड मुख्यतः IkB-alpha के विघटन, उसके बाद NF-kB के फॉस्फोरिलेशन और केंद्रक में प्रवेश के माध्यम से इसे प्रेरित करता है। इंटरफेरॉन-गामा मुख्यतः जेनस काइनेज़ द्वारा STAT1 के फॉस्फोरिलेशन और फिर STAT1 के केंद्रक में प्रवेश के माध्यम से इसे प्रेरित करता है। इसके बाद प्रत्येक कारक iNOS प्रमोटर पर अपने स्थल से बंधता है। एंजाइम गतिविधि और जीन का प्रेरण अलग-अलग नियंत्रण बिंदु हैं, और कोई दवा इनमें से किसी एक या दोनों पर कार्य कर सकती है।

मैक्रोफेज और एंडोटॉक्सिमिया वाले चूहों में iNOS प्रेरण के 2015 के अध्ययन ने इस प्रभाव को संदेश के स्तर पर पाया। RAW 264.7 कोशिकाओं और चूहों के प्राथमिक मैक्रोफेज में लिपोपॉलीसैकराइड, इंटरफेरॉन-गामा या दोनों से 30 मिनट पहले दिए गए 1 micromolar मेथिलीन ब्लू ने 8 से 24 घंटे के दौरान iNOS प्रोटीन और mRNA को कम किया। साथ ही माध्यम में नाइट्राइट कम रहा और कोशिकाओं की जीवित रहने की क्षमता में कोई कमी नहीं हुई। 25 mg per kg लिपोपॉलीसैकराइड दिए गए चूहों में, उससे एक घंटे पहले दी गई 5 mg per kg की एक खुराक ने फेफड़े, यकृत और हृदय में iNOS प्रोटीन और mRNA को कम किया।

इस अध्ययन की विशिष्ट बात यह है कि कुछ प्रक्रियाएँ नहीं बदलीं। IkB-alpha का विघटन, NF-kB का फॉस्फोरिलेशन, STAT1 का फॉस्फोरिलेशन और दोनों कारकों का केंद्रक में संचय बरकरार रहा। बाधा एक चरण बाद आई: केंद्रकीय अर्क में लिपोपॉलीसैकराइड के बाद NF-kB का अपने DNA तत्व से बंधन कम दिखा और इंटरफेरॉन-गामा के बाद STAT1 का बंधन कम दिखा। क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिपिटेशन ने पुष्टि की कि कोशिकाओं के भीतर iNOS प्रमोटर पर दोनों कारकों की उपस्थिति कम थी। ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर अल्फा भी घटा, जिसका प्रमोटर भी NF-kB का उपयोग करता है। कारक सक्रिय हुए और केंद्रक तक पहुँचे, लेकिन अपने लक्ष्य DNA से उनका जुड़ाव कमजोर रहा।

मार्ग 1 से इसका अंतर ध्यान में रखें। यह कारक और DNA के जुड़ाव से संबंधित है, इसमें STAT3 के बजाय STAT1 का उपयोग होता है, और इसमें ASC के बिंदुनुमा समूहों तथा कैस्पेस-1 के खंडों के बजाय mRNA, प्रोटीन और नाइट्राइट मापे जाते हैं। हमारा कोशिका मॉडलों में मेथिलीन ब्लू के लक्ष्यों का मानचित्र इस प्रतिलेखन स्तर को एंजाइम के प्रत्यक्ष और माइटोकॉन्ड्रियल मापों से अलग रखता है।

मार्ग 3: सीरम IL-6 और ऊतकों में STAT3 सक्रियण

IL-6, gp130 रिसेप्टर परिवार के माध्यम से जेनस काइनेज़ से STAT3 तक की क्रमिक प्रक्रिया में संकेत भेजता है। फॉस्फोरिलेटेड STAT3 डाइमर बनाता है, केंद्रक में प्रवेश करता है और सूजन-संबंधी कार्यक्रमों को चलाता है। वहीं, IL-6 स्वयं NF-kB का एक लक्ष्य है, इसलिए दोनों मिलकर एक फीडबैक लूप बनाते हैं, जिसे अक्सर IL-6 से STAT3 अक्ष कहा जाता है। इसके मानक मापनीय परिणाम हैं: मार्ग के पहले चरण में सीरम IL-6, फॉस्फोरिलेटेड STAT3 और कुल STAT3 का अनुपात तथा आगे के चरणों में iNOS और COX2 जैसे प्रभावकारी एंजाइम।

लिपोपॉलीसैकराइड के बाद IL-6 और STAT3 पर 2023 के चूहों के अध्ययन ने अलग-अलग शारीरिक हिस्सों में इस अक्ष को मापा। नर C57BL/6 चूहों को तीन दिनों तक प्रतिदिन 1 mg per kg लिपोपॉलीसैकराइड दिया गया और प्रत्येक खुराक के 30 मिनट बाद 5 या 10 mg per kg मेथिलीन ब्लू दिया गया। तीसरे दिन, केवल लिपोपॉलीसैकराइड वाले समूह की तुलना में दोनों मेथिलीन ब्लू समूहों में सीरम IL-6 कम था, जबकि पैनल के अधिकांश अन्य साइटोकाइन उपचार से नहीं बदले। कॉर्टेक्स, हिप्पोकैम्पस और कान की त्वचा में फॉस्फोरिलेटेड STAT3 और कुल STAT3 का अनुपात कम था। साथ ही Iba-1 माइक्रोग्लियल अभिरंजन, iNOS और COX2 कम थे तथा वजन में कमी आंशिक रूप से घटी थी।

यहाँ दो सावधानियाँ आवश्यक हैं। कम सीरम IL-6 के साथ ऊतकों में कम STAT3 फॉस्फोरिलेशन, अक्ष के नियमन के अनुरूप है, लेकिन इससे मुख्य प्रभावित बिंदु अलग से पहचाना नहीं जा सकता। पहले के चरण में कम साइटोकाइन, कम रिसेप्टर संकेतन या बदली हुई फॉस्फेटेज़ गतिविधि में से प्रत्येक यही अनुपात उत्पन्न कर सकता है। इसके अलावा, तीन दिनों के तीव्र उद्दीपन के दौरान वजन पूरे जीव का मापनीय परिणाम है, न कि लक्षणों या रोग-शमन का स्कोर। यह ब्लॉट से आगे का संदर्भ जोड़ता है, लेकिन संकेतन के परिणाम को उपचार के दावे में नहीं बदलता। माइटोकॉन्ड्रियल रेडॉक्स प्रक्रियाओं का अलग रसायनविज्ञान इस साइटोकाइन संबंधी विवरण के समानांतर चलता है और इसे इसके साथ नहीं मिलाना चाहिए।

मार्गों की तुलना: हस्तक्षेप के बिंदु और मापनीय परिणाम

यह तालिका तीन अनुचित निष्कर्षों से बचाती है। ASC के बिंदुनुमा समूहों का परिणाम, STAT3 के परिणाम को सिद्ध नहीं करता। STAT1 के iNOS प्रमोटर से जुड़ने का परिणाम, STAT3 के परिणाम को सिद्ध नहीं करता, भले ही दोनों प्रोटीन STAT परिवार के सदस्य हों। सीरम IL-6 का परिणाम, इन्फ्लामासोम संयोजन में कमी को सिद्ध नहीं करता: पेरिटोनियल प्रयोग में IL-1beta घटा, जबकि IL-6 नहीं घटा। प्रत्येक पंक्ति के लिए उसका अपना उद्दीपक और मापनीय परिणाम आवश्यक है। इसलिए मेथिलीन ब्लू पर कोशिका, पशु और नैदानिक अध्ययनों को पढ़ते समय हर दावे को उस स्तर से मिलाना आवश्यक है जिस पर उसे मापा गया था।

इनमें से कोई भी निष्कर्ष मनुष्यों में खुराक, सुरक्षा या लाभ स्थापित नहीं करता। लिपोपॉलीसैकराइड मॉडल किसी प्रक्रिया की जाँच के लिए नियंत्रित उद्दीपक हैं, दीर्घकालिक बीमारी की प्रतिकृतियाँ नहीं। उद्दीपक के साथ खुराक देना, पहले से स्थापित रोग को उलटने के बजाय प्रेरित परिवर्तन की रोकथाम का परीक्षण करता है। इस प्रक्रियागत विवरण को रोगियों के परिणामों से अलग रखें और किसी भी स्वास्थ्य दावे को उसके पीछे मौजूद रोगियों पर किए गए अध्ययन के आधार पर परखें।