G6PD प्रयोगशाला परीक्षणों में मेथिलीन ब्लू: यह रंजक वास्तव में क्या करता है

एक विद्यार्थी ऊष्मायन के बाद दो परखनलियों को देखता है। एक का रंग अपेक्षा के अनुसार बदल गया है। दूसरी का नहीं बदला। विद्यार्थी निष्कर्ष निकालता है कि दूसरे रोगी में ग्लूकोज़-6-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज़ की कमी है। यह निष्कर्ष सही हो सकता है, लेकिन इस तर्क में उस अवधारणा को छोड़ दिया गया है जिसके कारण परीक्षण काम करता है। परखनली में कोई भी चीज़ एंजाइम को सीधे नहीं मापती। परखनली में एंजाइम द्वारा उत्पन्न पदार्थ को मापा जाता है, और मेथिलीन ब्लू इसमें मध्यस्थ का काम करता है।

मापन की यह अप्रत्यक्ष प्रकृति स्पष्ट हो जाने पर प्रक्रिया, नियंत्रण नमूने और गलत परिणामों की लंबी सूची मनमानी नहीं लगती।

संक्षिप्त उत्तर

G6PD परीक्षण में मेथिलीन ब्लू एक रेडॉक्स संकेतक है। G6PD एंजाइम NADPH उत्पन्न करता है, और NADPH पर निर्भर प्रणालियाँ नीले मेथिलीन ब्लू का अपचयन करके उसे उसके रंगहीन ल्यूको रूप में बदलती हैं या उसका उपयोग इलेक्ट्रॉनों के स्थानांतरण के लिए करती हैं। एंजाइम की सामान्य सक्रियता से अपचयन कुशलता से होता है। सक्रियता में कमी होने पर अपचयन धीमा या अधूरा होता है। परीक्षण का पूरा संकेत यही है।

दो ऐतिहासिक विधियों में इसी रंजक का उपयोग होता है, लेकिन उनके अंतिम संकेत अलग हैं। उन्हें अलग-अलग समझने से अधिकांश भ्रम दूर हो जाता है।

दो परीक्षण, एक रंजक, अलग अंतिम संकेत

पहला प्रत्यक्ष मेथिलीन ब्लू अपचयन परीक्षण है, जिसका वर्णन सैस और उनके सहयोगियों ने किया था और जिसका बाद में गिब्स ने मूल्यांकन किया। इसमें अंतिम संकेत स्वयं रंजक देता है: ऑक्सीकृत नीले मेथिलीन ब्लू का अपचयन होता है और वह रंगहीन ल्यूकोमेथिलीन ब्लू की ओर बदलता है। इस परिवर्तन की दर NADPH उत्पन्न करने की क्षमता दर्शाती है। स्क्रीनिंग से संबंधित मूल शोधपत्र PubMed पर सैस और अन्य (1966) के नाम से सूचीबद्ध है।

दूसरा ब्रूअर मेथेमोग्लोबिन अपचयन परीक्षण है। सोडियम नाइट्राइट पहले हीमोग्लोबिन को ऑक्सीकृत करके भूरे मेथेमोग्लोबिन में बदलता है। इसके बाद मेथिलीन ब्लू इलेक्ट्रॉन स्थानांतरण के मध्यस्थ के रूप में काम करता है: अपचयित मेथिलीन ब्लू मेथेमोग्लोबिन को अपचायक समतुल्य प्रदान करता है, जिससे वह फिर लाल हीमोग्लोबिन में बदल जाता है। इसलिए दिखाई देने वाला अंतिम संकेत भूरा बनाम लाल है, नीला बनाम रंगहीन नहीं। मूल विधि विश्व स्वास्थ्य संगठन के बुलेटिन (ब्रूअर और अन्य, 1960) में प्रकाशित हुई थी।

ब्रूअर परीक्षण को रंजक का रंग हटाने वाला परीक्षण कहना रासायनिक दृष्टि से सटीक नहीं है। रंजक चक्रीय रूप से ऑक्सीकृत और अपचयित होता है; रंग हीमोग्लोबिन का बदलता है। नीचे दिया गया आरेख दोनों मार्ग दिखाता है।

मूल अभिक्रिया

G6PD पेंटोज़ फॉस्फेट मार्ग के पहले ऑक्सीकरण चरण को उत्प्रेरित करता है:

Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+

परिपक्व लाल रक्त कोशिकाएँ NADPH के लिए इस मार्ग पर काफी निर्भर करती हैं। इसकी समीक्षा ब्लड में लुज़ात्तो और उनके सहयोगियों (2020) ने की है। NADPH ग्लूटाथियोन को अपचयित अवस्था में रखता है और कोशिका को ऑक्सीकरण से होने वाली क्षति से बचाता है। मेथिलीन ब्लू इस व्यवस्था में इलेक्ट्रॉन ग्राही के रूप में जुड़ता है। पर्याप्त G6PD से पर्याप्त NADPH मिलता है, जिससे अपचयन कुशलता से होता है। G6PD की कमी इस शृंखला को उसकी पहली कड़ी पर ही बाधित कर देती है।

रंजक को इंजन के बजाय ईंधन का स्तर बताने वाला मीटर समझें। यह NADPH की उपलब्धता दर्शाता है। इस उपलब्धता या परिणाम पढ़ने की प्रक्रिया को बदलने वाला कोई भी अन्य कारक जीन में कोई बदलाव हुए बिना भी मीटर का संकेत बदल सकता है।

ब्रूअर प्रकार की प्रक्रिया कैसे की जाती है

अभिकर्मकों के मिश्रण दशकों के दौरान बदलते रहे हैं, इसलिए शिक्षण के लिए दिए गए विवरण को नैदानिक प्रोटोकॉल नहीं समझना चाहिए। प्रत्येक प्रयोगशाला अपनी मान्यीकृत मानक संचालन प्रक्रिया का पालन करती है। इस सावधानी के साथ, परखनलियों की पारंपरिक व्यवस्था नीचे दिए गए तरीके से काम करती है। तीन परखनलियों और 3 घंटे के ऊष्मायन वाली यह प्रक्रिया इस प्रकाशित कार्यान्वयन में दर्ज है:

1. रोगी की परखनली: संपूर्ण रक्त में ग्लूकोज़, सोडियम नाइट्राइट और मेथिलीन ब्लू मिलाया जाता है। नाइट्राइट मेथेमोग्लोबिन बनाता है, ग्लूकोज़ लाल रक्त कोशिकाओं के चयापचय के लिए ईंधन देता है और रंजक NADPH पर निर्भर इलेक्ट्रॉन स्थानांतरण का माध्यम बनता है।
2. ऑक्सीकृत नियंत्रण: रक्त में नाइट्राइट और ग्लूकोज़ मिलाए जाते हैं, लेकिन मेथिलीन ब्लू नहीं। यह भूरे मेथेमोग्लोबिन का अंतिम संकेत दिखाता है, जो कमी वाला प्रतिरूप है।
3. हीमोग्लोबिन नियंत्रण: रक्त में पानी मिलाया जाता है। यह लाल हीमोग्लोबिन का अंतिम संकेत दिखाता है, जो सामान्य प्रतिरूप है।
4. सभी परखनलियों को लगभग 37 C पर, आम तौर पर 3 घंटे तक, हल्के से मिलाते हुए ऊष्मायित करें।
5. प्रत्येक परखनली से थोड़ी मात्रा लेकर आसुत जल में तनु करें, ताकि कोशिकाएँ टूट जाएँ और रंगों की तुलना स्पष्ट रूप से की जा सके।
6. रोगी की परखनली की दोनों नियंत्रणों से तुलना करें। रंग का फिर लाल की ओर लौटना पर्याप्त अपचयन क्षमता दर्शाता है। रंग का भूरा बने रहना स्पष्ट कमी का संकेत देता है।

एक ऐतिहासिक मिश्रण में लगभग 1 mL रक्त के साथ ऐसे अभिकर्मक इस्तेमाल किए गए थे जिनमें सोडियम नाइट्राइट लगभग 180 mM, डेक्सट्रोज़ 280 mM और मेथिलीन ब्लू 0.4 mM था। इन संख्याओं को साहित्य में दिए गए एक उदाहरण के रूप में लें, सार्वभौमिक विनिर्देश के रूप में नहीं।

परिणाम पढ़ना

गुणात्मक स्क्रीनिंग सामान्य सक्रियता के लगभग 30 से 40 प्रतिशत के आसपास सबसे अच्छी तरह भेद करती है। इसकी चर्चा G6PD का पता लगाने में रह जाने वाली कमियों पर मलेरिया जर्नल की इस समीक्षा में की गई है। इसलिए स्क्रीनिंग का सामान्य परिणाम यह बताता है कि परीक्षण में गंभीर कमी का पता नहीं चला। यह पूरी तरह सामान्य सक्रियता प्रमाणित नहीं करता।

स्क्रीनिंग भ्रामक क्यों हो सकती है

हीमोलाइसिस के बाद रेटिकुलोसाइटोसिस गलत सामान्य परिणाम का एक प्रमुख उदाहरण है। युवा लाल रक्त कोशिकाओं और रेटिकुलोसाइटों में पुरानी कोशिकाओं की तुलना में अधिक G6PD होता है। तीव्र हीमोलाइसिस के दौरान सबसे पुरानी और सबसे अधिक कमी वाली कोशिकाएँ पहले ही नष्ट हो सकती हैं। इसके बाद युवा कोशिकाओं का ऐसा समूह बचता है जिसकी सक्रियता परीक्षण में सामान्य आती है। यही जैविक स्थिति मात्रात्मक परीक्षणों को भी भ्रमित करती है, केवल रंजक आधारित स्क्रीनिंग को नहीं।

हाल में हुआ रक्त आधान कमी को छिपा देता है, क्योंकि दाता की लाल रक्त कोशिकाएँ नमूने में अपना एंजाइम भी जोड़ती हैं। मेयो क्लिनिक लेबोरेटरीज़ रक्त आधान को अविश्वसनीय एंजाइम परिणामों के कारणों में शामिल करती है, साथ ही रेटिकुलोसाइटोसिस और श्वेत रक्त कोशिकाओं से होने वाले हस्तक्षेप को भी।

विषमयुग्मजी महिलाओं के परिणामों की व्याख्या सबसे कठिन होती है। X-गुणसूत्र के यादृच्छिक निष्क्रियण से सामान्य और कमी वाली लाल रक्त कोशिकाओं का मिश्रण बनता है। कुल सक्रियता गंभीर कमी से लेकर दिखने में सामान्य स्तर तक कहीं भी हो सकती है। गुणात्मक स्क्रीनिंग में मध्यवर्ती फीनोटाइप अक्सर पकड़ में नहीं आते। G6PD परीक्षण पर WHO के दस्तावेज़ में इस सीमा की विस्तृत चर्चा है।

नमूना कितना पुराना है, भंडारण का तापमान, दृश्य अंतिम संकेत का व्यक्तिपरक आकलन, हेमाटोक्रिट और अभिकर्मकों की गुणवत्ता, इन जैविक प्रभावों के अलावा विश्लेषण में अतिरिक्त परिवर्तनशीलता पैदा करते हैं।

स्क्रीनिंग निदान नहीं है

स्क्रीनिंग में कमी वाला, मध्यवर्ती या नैदानिक स्थिति से मेल न खाने वाला परिणाम मिलने पर मात्रात्मक G6PD एंजाइम परीक्षण आवश्यक होता है। WHO तापमान नियंत्रित मात्रात्मक स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री को संदर्भ विधि मानता है। इस परीक्षण में लाल रक्त कोशिकाओं के हीमोलाइसेट में ग्लूकोज़-6-फॉस्फेट और NADP+ मिलाए जाते हैं। बनने वाले NADPH को 340 nm पर बढ़ते अवशोषण के माध्यम से मापा जाता है। परिवर्तन की दर एंजाइम की सक्रियता के समानुपाती होती है। इसे आम तौर पर हीमोग्लोबिन के प्रति ग्राम इकाइयों के रूप में सामान्यीकृत किया जाता है। वर्तमान नैदानिक प्रयोगशाला पद्धति का सार G6PD सक्रियता के लिए मेयो परीक्षण सूची की प्रविष्टि में दिया गया है।

व्याख्या में प्रयोगशाला की मान्यीकृत संदर्भ सीमा का उपयोग होता है, जिसे अक्सर जनसंख्या की सामान्य सक्रियता के सापेक्ष बताया जाता है। कमी पर चर्चा आम तौर पर 30 प्रतिशत की सीमा के आसपास और मध्यवर्ती सक्रियता पर चर्चा उससे ऊपर के स्तरों पर होती है। G6PD परीक्षणों के लिए WHO के लक्षित उत्पाद प्रोफाइल (2022) इस नैदानिक ढाँचे को स्पष्ट करते हैं। यदि हाल का हीमोलाइसिस या रक्त आधान फीनोटाइप निर्धारण को अविश्वसनीय बनाता है, तो लाल रक्त कोशिकाओं की आबादी दोबारा संतुलित होने के बाद परीक्षण दोहराएँ। आणविक परीक्षण अतिरिक्त जानकारी दे सकता है, लेकिन एंजाइम के मापन की जगह नहीं लेता।

एक अंतर जिसे स्पष्ट रखना आवश्यक है

इन परीक्षणों में मेथिलीन ब्लू एक शरीर के बाहर इस्तेमाल किया जाने वाला प्रयोगशाला अभिकर्मक है। यह बात किसी रोगी को मेथिलीन ब्लू देने की सुरक्षा से अलग विषय है, जिसे मेथिलीन ब्लू के उपयोग की निषिद्ध स्थितियों पर मार्गदर्शन में समझाया गया है। दोनों का जैव रसायन जुड़ा है, क्योंकि औषधि भी NADPH पर निर्भर अपचयन पर निर्भर करती है। लेकिन परखनली में मौजूद रंजक और रक्तप्रवाह में दी गई खुराक एक जैसी बात नहीं हैं। किसी दूसरे संदर्भ में अभिरंजक के रूप में इसके व्यवहार को समझने के लिए मेथिलीन ब्लू अभिरंजन के सिद्धांत देखें। इसके रासायनिक परिवार के संदर्भ के लिए प्रयोगशाला में उपयोग होने वाले रेडॉक्स रंजकों का विषय देखें।

स्क्रीनिंग यह जाँचती है कि अपचयन क्षमता सामान्य दिखती है या नहीं। पुष्टिकरण यह जाँचता है कि एंजाइम वास्तव में कितना मौजूद है। रंजक पहले प्रश्न का उत्तर अच्छी तरह देता है, बशर्ते उससे दूसरे प्रश्न का उत्तर देने की अपेक्षा न की जाए।