DNA और RNA रंजन के लिए मेथिलीन ब्लू: जेल और झिल्ली में अनुप्रयोग

एक छात्र एगारोज़ जेल चलाता है, उसे मेथिलीन ब्लू से रंजित करता है और जहाँ स्पष्ट बैंड की अपेक्षा थी, वहाँ कुछ नहीं दिखता। पास के कार्यक्षेत्र में एक पोस्टडॉक उसी नीली बोतल से नॉर्दर्न झिल्ली का रंजन करता है और तीन मिनट में स्पष्ट राइबोसोमल बैंड प्राप्त करता है। छात्र निष्कर्ष निकालता है कि जेल की प्रक्रिया विफल रही। जेल की प्रक्रिया विफल नहीं हुई थी। दोनों कार्य अलग थे, और एक ही रंजक उनके लिए अलग संवेदनशीलता, अलग पृष्ठभूमि और आगे की प्रक्रियाओं के अलग नियमों के साथ परिणाम देता है।

मेथिलीन ब्लू से DNA और RNA रंजन का रसायन समान है, लेकिन उद्देश्य अलग हैं। जेल में रंजक बताता है कि छिद्रयुक्त मैट्रिक्स के भीतर कितना न्यूक्लिक अम्ल मौजूद है। झिल्ली पर यह बताता है कि स्थानांतरण सफल हुआ या नहीं और लेनों में समान मात्रा में नमूना लोड किया गया या नहीं। यह अंतर स्पष्ट होने पर प्रोटोकॉल, पहचान की सीमाएँ और अनुकूलता की सीमाएँ समझ में आ जाती हैं।

संक्षिप्त उत्तर

मेथिलीन ब्लू एक समतलीय धनायनिक रंजक है। यह फॉस्फेट के प्रति स्थिरवैद्युत आकर्षण, क्षारक युग्मों के बीच अंतर्वेशन और लघु खाँच से जुड़ाव के मिश्रण के माध्यम से न्यूक्लिक अम्लों से असहसंयोजक और उत्क्रमणीय रूप से बंधता है। यही उत्क्रमणीयता इसका मुख्य उपयोगी गुण है। बैंडों का रंजन करके उन्हें दृश्य प्रकाश में देखा जा सकता है, उनकी छवियाँ दर्ज की जा सकती हैं और फिर क्लोनिंग, संकरण या दोबारा प्रोबिंग के लिए रंजक हटाया या नमूना शुद्ध किया जा सकता है।

द्विरज्जु DNA के लिए एगारोज़ जेल में मेथिलीन ब्लू रंजन की मानक त्वरित विधि में पानी में 0.02 प्रतिशत w/v (200 माइक्रोग्राम प्रति mL) रंजक, लगभग 15 मिनट रंजन और लगभग 15 मिनट पानी से विरंजन शामिल है। इसे श्वेत प्रकाश बॉक्स पर देखा जाता है। झिल्लियों के लिए पारंपरिक नॉर्दर्न ब्लॉट विधि में लगभग pH 5.2 पर सोडियम एसीटेट में 0.02 से 0.04 प्रतिशत रंजक का उपयोग किया जाता है। स्थानांतरण और स्थिरीकरण के बाद कुछ मिनट रंजन किया जाता है, फिर पानी से धोया जाता है और संकरण से पहले रंजक पूरी तरह हटाया जाता है। संवेदनशीलता सीमित है: अच्छी परिस्थितियों में प्रति जेल बैंड दसियों से सैकड़ों नैनोग्राम, जबकि सावधानीपूर्ण मार्गदर्शिकाएँ 0.5 से 1 माइक्रोग्राम बताती हैं। यह एथिडियम ब्रोमाइड और SYBR रंजकों की तुलना में कई परिमाण-क्रम अधिक है। झिल्लियों पर किसी एक ट्रांसक्रिप्ट के लिए कोई उपयोगी पहचान सीमा नहीं है, क्योंकि रंजक मुख्यतः प्रचुर मात्रा में मौजूद राइबोसोमल RNA और लोड की गई कुल सामग्री दिखाता है। किसी भी विधि में खुदरा सप्लीमेंट विलयन को विकल्प के रूप में इस्तेमाल न करें। सत्यापित विधियाँ विश्लेषणात्मक श्रेणी के रंजक, निर्धारित बफर और RNA के मामले में RNase-मुक्त संचालन पर आधारित हैं।

बंधन कैसे होता है और कहाँ भ्रम पैदा करता है

उपयोगी मॉडल के तीन भाग हैं। पहला, धनावेशित वलय तंत्र ऋणावेशित फॉस्फेट आधार-ढाँचे की ओर आकर्षित होता है। स्पेक्ट्रोस्कोपिक अध्ययन बताते हैं कि कम लवण सांद्रता पर यह स्थिरवैद्युत घटक प्रमुख होता है, जबकि मॉडलिंग और आणविक गतिकी द्विरज्जु DNA के लिए अंतर्वेशन और लघु खाँच बंधन को स्थिर बंधन प्रकार मानते हैं। इसका सार मेथिलीन ब्लू के DNA बंधन के एक स्पेक्ट्रोस्कोपिक अध्ययन में दिया गया है। दूसरा, GC के प्रति कुछ प्राथमिकता होती है। मॉडलिंग CpG और GpC क्रमिक युग्मों को प्राथमिकता देती है, और प्रयोग GC-समृद्ध द्विरज्जुओं के साथ प्राथमिक जुड़ाव दिखाते हैं, जैसा कि मेथिलीन ब्लू की अंतर्वेशन प्राथमिकताओं पर किए गए कार्य में बताया गया है। हालाँकि, AT द्विरज्जु भी बंधते हैं। नियमित रंजन अनुक्रम-विशिष्ट नहीं होता। तीसरा, एकलरज्जु DNA और RNA मुख्यतः स्थिरवैद्युत आकर्षण तथा सुलभ क्षारकों और द्विरज्जु क्षेत्रों के साथ स्टैकिंग के माध्यम से बंधते हैं। इसलिए रंजन की तीव्रता लंबाई, अनुक्रम और द्वितीयक संरचना के अनुसार बदलती है।

इसके दो परिणाम हैं। बंधन असहसंयोजक होने के कारण रंजक धुलकर निकल जाता है। पॉलीएक्रिलामाइड बैंड जल्दी फीके पड़ते हैं, जब तक उन्हें जानबूझकर स्थायी रूप से फिक्स न किया जाए। स्थायी फिक्सेशन की एक विशेष विधि इसी कारण उपलब्ध है कि सामान्य रंजन अस्थायी होता है, जैसा कि PAGE जेलों के लिए Soto और Draper ने वर्णित किया है। रंजक प्रकाशसंवेदीकारक होने के कारण ऑक्सीजन की उपस्थिति में रंजित DNA को लंबे समय तक तेज प्रकाश में रखने से ग्वानिन का ऑक्सीकरण हो सकता है और अंततः रज्जुओं में कट लग सकते हैं। इस क्रियाविधि का विवरण मेथिलीन ब्लू द्वारा प्रकाशसंवेदीकृत ग्वानिन ऑक्सीकरण पर किए गए कार्य में दिया गया है। श्वेत प्रकाश में थोड़े समय तक देखने से पारंपरिक एथिडियम ब्रोमाइड कार्यप्रणालियों की जानी-पहचानी UV क्षति से बचा जा सकता है। आगे उपयोग के लिए DNA निकालते समय यह वास्तविक लाभ है। दृश्य प्रकाश कम क्षतिकारक है, लेकिन हानिरहित नहीं। यदि DNA की क्लोनिंग करनी है, तो प्रकाश में रखने का समय कम रखें। इस सावधानी के पीछे के व्यापक प्रकाशरसायन के लिए मेथिलीन ब्लू प्रकाशरसायन के दो मार्ग देखें। ऑक्सीकृत रूप क्यों बंधता है और अपचयित रूप क्यों नहीं, इसे समझाने वाले रेडॉक्स युग्म और आवेश अवस्थाओं के लिए मेथिलीन ब्लू की संरचना और गुणों का रसायन देखें।

पहला कार्य: जेल के भीतर रंजन

जेल रंजन एक प्रश्न का उत्तर देता है: क्या इस बैंड में इतना न्यूक्लिक अम्ल है कि वह आँख से दिखाई दे सके। एगारोज़ में द्विरज्जु DNA का मामला सबसे अच्छी तरह अध्ययन किया गया है। Flores और सहकर्मियों की मूल मेथिलीन ब्लू जेल विधि ने 1 प्रतिशत एगारोज़ पर 0.02 प्रतिशत वाले त्वरित प्रोटोकॉल को सत्यापित किया और उसके बाद सफल DNA प्राप्ति तथा क्लोनिंग दिखाई। यही आपूर्तिकर्ता प्रोटोकॉल IBI Scientific के मेथिलीन ब्लू उत्पाद पृष्ठ पर भी उपलब्ध है, जहाँ 0.04 प्रतिशत वाली झिल्ली विधि और त्वरित जेल विधि साथ-साथ दी गई हैं।

व्यावहारिक कार्यप्रणाली:

1. जेल सामान्य रूप से चलाएँ। वैद्युतकणसंचलन के बाद रंजन करें, उसके दौरान नहीं, जब तक किसी संशोधित विधि के लिए स्थानांतरण या विभेदन को सत्यापित न किया गया हो।
2. आसुत पानी में 0.02 प्रतिशत w/v मेथिलीन ब्लू में लगभग 15 मिनट डुबोकर रखें और हल्का हिलाते रहें।
3. पानी कई बार बदलकर कुल लगभग 15 मिनट विरंजन करें, जब तक मैट्रिक्स की पृष्ठभूमि का रंग कम न हो जाए और बैंड स्पष्ट न दिखने लगें।
4. श्वेत प्रकाश प्रकाशक पर तुरंत तस्वीर लें।

एगारोज़ और पॉलीएक्रिलामाइड अलग व्यवहार करते हैं। एगारोज़ मैट्रिक्स में रंजक बनाए रखता है, इसलिए विरंजन धीमा चरण होता है। पतले पॉलीएक्रिलामाइड जेल जल्दी रंजित होते हैं, लेकिन रंजक भी जल्दी खो देते हैं। इससे आगे उपयोग के लिए बैंड काटकर निकालना आसान होता है, लेकिन लंबे समय के अभिलेख रखना कठिन होता है। पॉलीएक्रिलामाइड में संश्लेषित ऑलिगोन्यूक्लियोटाइडों का स्थान उसी 0.02 प्रतिशत विधि से, बार-बार पानी से धोते हुए, 20 से 30 मिनट में पता लगाया जा सकता है। यह स्थापित Current Protocols शैली की PAGE विधियों के अनुरूप है। आगे उपयोग के लिए ऑलिगो तैयार करने हेतु तनु TBE में लगभग 0.0002 प्रतिशत वाले अत्यधिक तनु विकल्पों का कई घंटों तक उपयोग रिपोर्ट किया गया है, लेकिन उनके समर्थन में साक्ष्य कम मजबूत हैं।

DNA और RNA का अंतर महत्त्वपूर्ण है। द्विरज्जु DNA सबसे मजबूत संरचनात्मक बंधन देता है। RNA और एकलरज्जु DNA का भी रंजन होता है, लेकिन वह कमजोर और कम पूर्वानुमेय होता है। फॉर्मल्डिहाइड एगारोज़ RNA जेलों के लिए अधिकांश प्रयोगशालाएँ जेल में नीला रंजन नहीं करतीं। वे पहले RNA को झिल्ली पर स्थानांतरित करती हैं और फिर वहाँ रंजन करती हैं। इससे कमजोर जेल संकेत के स्थान पर अधिक स्पष्ट झिल्ली संकेत और लोडिंग का अभिलेख मिलता है।

दूसरा कार्य: झिल्लियों पर रंजन

झिल्ली रंजन एक अलग प्रश्न का उत्तर देता है: क्या स्थानांतरण सफल हुआ और क्या लेनों की तुलना की जा सकती है। इसका पारंपरिक अनुप्रयोग Herrin और Schmidt का उत्क्रमणीय नॉर्दर्न ब्लॉट रंजन है। मूल विधि में pH 5.0 पर 50 mM सोडियम एसीटेट में 0.04 प्रतिशत रंजक से 2 से 3 मिनट रंजन किया जाता था और पानी से धोया जाता था। संकरण से पहले SSPE में तनु SDS से रंजक हटाया जा सकता था।

व्यापक रूप से इस्तेमाल होने वाला आधुनिक विकल्प इस प्रकार है:

1. RNA या विकृत DNA को नायलॉन या नाइट्रोसेल्युलोज़ पर स्थानांतरित करें, फिर UV क्रॉसलिंकिंग या गर्म करके स्थिर करें, ताकि रंजन के दौरान नमूना न निकल जाए।
2. वैकल्पिक, लेकिन सामान्य चरण: झिल्ली को लगभग 15 मिनट 5 प्रतिशत एसिटिक अम्ल में भिगोएँ।
3. लगभग pH 5.2 पर 0.3 से 0.5 M सोडियम एसीटेट में 0.02 से 0.04 प्रतिशत मेथिलीन ब्लू से 5 से 10 मिनट रंजन करें।
4. पानी से धोएँ और 5 से 15 मिनट विरंजन करें, छवि दर्ज करें, फिर संकरण से पहले बचा हुआ रंजक हटा दें।

नॉर्दर्न कार्य में धनावेशित नायलॉन का सबसे अधिक उपयोग होता है। नाइट्रोसेल्युलोज़ भी उसी एसिटिक अम्ल और एसीटेट वाली कार्यप्रणाली के साथ काम करता है। छवि का उपयोग स्थानांतरण की पुष्टि करने, 28S और 18S बैंडों की तुलना करने (या जीवाणु RNA के लिए 23S और 16S), लैडर और मानकों को चिह्नित करने तथा कुल RNA के सामान्यीकरण का अनुमानित अभिलेख रखने के लिए किया जाता है। प्रकाशित नॉर्दर्न विधियाँ लोडिंग की जाँच के लिए रंजित राइबोसोमल बैंडों की मात्रा मापती हैं। इनमें डेयरी विज्ञान का वह कार्य भी शामिल है जिसमें सामान्यीकरण के लिए मेथिलीन ब्लू से रंजित राइबोसोमल बैंडों का उपयोग किया गया था। सदर्न झिल्लियों को भी इसी तरह देखा जा सकता है, लेकिन रंजक नॉर्दर्न लोडिंग और स्थानांतरण की जाँच के रूप में कहीं अधिक स्थापित है। सदर्न DNA को स्थानांतरण से पहले विकृत किया जाता है, इसलिए जेल संवेदनशीलता के आँकड़े उस पर सीधे लागू नहीं होते।

पहचान की सीमाएँ और पृष्ठभूमि: जहाँ नीला रंजक पीछे रह जाता है

नीचे दी गई तुलना जानबूझकर अनुमानित रखी गई है। रंजक का प्रदर्शन जेल प्रतिशत, बैंड की चौड़ाई, प्रकाशिकी और विरंजन में सावधानी पर निर्भर करता है। प्रत्येक संख्या को परिमाण-क्रम का अनुमान मानें, विनिर्देश नहीं।

पृष्ठभूमि नियंत्रण तय करता है कि सीमित संकेत उपयोगी होगा या नहीं। मुक्त रंजक का रंग बहुत गहरा होता है, इसलिए कंट्रास्ट पाने के लिए बंधे हुए रंजक को हटाए बिना अबंधित रंजक निकालना आवश्यक है। अधिक सांद्र रंजक से संवेदनशीलता शायद ही बढ़ती है। मुख्यतः विरंजन का समय बढ़ता है। ठीक उसी जेल, झिल्ली और कैमरे पर तनुकरण श्रृंखला जाँचें और केवल उस सीमा का उपयोग करें जहाँ समाकलित घनत्व नमूने की इनपुट मात्रा के समानुपाती रहता है। मेथिलीन ब्लू अर्धमात्रात्मक लोडिंग सामान्यीकरण में उपयोगी है। यह व्यापक गतिशील सीमा वाला मात्रात्मक परीक्षण नहीं है, क्योंकि झिल्ली की क्षमता, स्थानांतरण दक्षता, संतृप्ति और विरंजन लेन-दर-लेन बदलते हैं।

अनुकूलता की सीमाएँ: रंजन के बाद क्या काम करता है

नीले रंजन के बाद क्लोनिंग प्रदर्शित की गई है। Flores और सहकर्मियों ने रंजित एगारोज़ बैंड काटकर निकाले, DNA प्राप्त किया और उसका लाइगेशन तथा ट्रांसफॉर्मेशन किया। उन्होंने UV के साथ एथिडियम ब्रोमाइड उपयोग करने के बाद की तुलना में बेहतर क्लोनिंग रिपोर्ट की। इसका संभावित कारण कम प्रकाशजनित क्षति है, रंजक का कोई अपना लाभ नहीं। श्वेत प्रकाश में रखने का समय कम रखें और प्राप्त DNA को सामान्य जेल निष्कर्षण शुद्धिकरण से गुजारें।

PCR और अनुक्रमण के लिए साक्ष्य कम हैं। बचा हुआ रंजक न्यूक्लिक अम्लों से बंधता है, इसलिए एंजाइम संबंधी चरणों से पहले विरंजन और शुद्धिकरण करें। नीले जेल से उचित रूप से शुद्ध किया गया DNA काम करने की अपेक्षा है, लेकिन अलग-अलग पॉलीमरेज़ और अनुक्रमण रसायनों में सीधे साथ पहुँचने वाले रंजक की सहनशील मात्रा अच्छी तरह मापी नहीं गई है। इसे मानकर न चलें।

ब्लॉट संकरण के साथ अनुकूलता तभी बनी रहती है जब क्रम का कड़ाई से पालन हो: स्थानांतरण, स्थिरीकरण, रंजन, छवि दर्ज करना, विरंजन, संकरण। यही Herrin और Schmidt की विधि है। स्थानांतरण से पहले रंजन करना या विरंजन छोड़ देना अलग विधि है, जिसके लिए स्वतंत्र सत्यापन आवश्यक है। रंजक हटाने के बाद मानक प्रोब हटाने और दोबारा प्रोबिंग की प्रक्रियाएँ सामान्य रूप से की जा सकती हैं। इसी रंजक परिवार से कोशिका स्तर पर रंजन और फिक्स किए गए नमूने की फिल्म का तर्क जीवित कोशिका विधियों पर क्यों लागू नहीं होता, इसके लिए माइक्रोस्कोपी रंजन एटलस देखें।

आगे उपयोग के लिए एगारोज़ बैंडों और नीले रंजक से पहचाने गए PAGE ऑलिगो को काटकर निकालना संभव है, बशर्ते स्थायी फिक्सेशन वाली विधि का उपयोग न किया जाए। उत्क्रमणीय रूप से बंधने वाले रंजक के मामले में विरंजन के बाद इलेक्ट्रोएल्यूशन रासायनिक दृष्टि से संभव है, लेकिन मेथिलीन ब्लू के लिए विशेष रूप से नियंत्रित प्राप्ति-दर के आँकड़े कम हैं। एल्यूशन के बाद लवण हटाएँ या अवक्षेपण करें।

बार-बार होने वाली विफलताएँ

हल्के जेल बैंड आमतौर पर बताते हैं कि वर्णमितीय रंजन के लिए पर्याप्त द्रव्यमान नहीं है, विशेषकर छोटे एकलरज्जु या RNA लक्ष्यों के लिए। अधिक नमूना लोड करें, ताज़ा रंजक इस्तेमाल करें, सांद्रता बढ़ाने से पहले रंजन का समय बढ़ाएँ और विरंजन पहले रोक दें। बिना कंट्रास्ट वाला पूरी तरह नीला जेल आमतौर पर अत्यधिक रंजन या पानी बहुत कम बार बदलने का संकेत है। PAGE बैंडों का फीका पड़ना अपेक्षित रासायनिक व्यवहार है, रंजन की विफलता नहीं। तुरंत तस्वीर लें। झिल्ली की असमान पृष्ठभूमि सिलवटों, बुलबुलों, उँगलियों के निशानों, असमान हिलाने या जगह-जगह अधूरे स्थानांतरण की ओर संकेत करती है। संकरण नियंत्रण के बिना इसे असमान लोडिंग न मानें। धुँधला और कमजोर राइबोसोमल पैटर्न विघटन का संकेत हो सकता है, लेकिन इसका कारण अधूरा स्थानांतरण, बहुत कम कुल RNA (सामान्य लेनों में कई से लेकर दसियों माइक्रोग्राम होते हैं) या अत्यधिक विरंजन भी हो सकता है। रंजक प्रचुर मात्रा में मौजूद राइबोसोमल RNA दिखाता है। यह किसी विशिष्ट ट्रांसक्रिप्ट की जानकारी नहीं देता। वह कार्य प्रोब का है।

अतिरंजित दावों के बिना सुरक्षा और संचालन

मेथिलीन ब्लू का संचालन एथिडियम ब्रोमाइड से सरल है, लेकिन यह हानिरहित नहीं है। MilliporeSigma की वर्तमान सुरक्षा डेटा शीट रंजक को तीव्र मौखिक विषाक्तता श्रेणी 4 में वर्गीकृत करती है और निगलने पर हानिकारक बताती है। Sigma-Aldrich की मेथिलीन ब्लू SDS के अनुसार इसका निपटान अनुमोदित अपशिष्ट मार्ग से किया जाना चाहिए। एथिडियम ब्रोमाइड के लिए अधिक गंभीर आनुवंशिक विषाक्तता चेतावनियाँ हैं, जिनमें उसकी Sigma-Aldrich एथिडियम ब्रोमाइड SDS में जनन कोशिकाओं पर संदिग्ध प्रभाव भी शामिल हैं। उसके जेल और विलयन आमतौर पर खतरनाक रासायनिक अपशिष्ट के रूप में अलग रखे जाते हैं, जैसा कि Thermo Fisher की न्यूक्लिक अम्ल रंजक मार्गदर्शिका में बताया गया है। दोनों के लिए SDS और संस्थागत नियमों का पालन करें। सूखे रंजक को कसकर बंद और सूखा रखें, कार्यशील रंजक का दोबारा उपयोग केवल प्रोटोकॉल की अनुमति के अनुसार करें, रंजित झिल्लियों को फिल्टर शीटों के बीच सूखा रखें और जेल बैंड विसरित होकर फैलने से पहले तस्वीर लें।

प्रयोगशाला की यह बात याद रखें। जेल श्वेत प्रकाश में अधिक लोड की गई मात्रा की दृश्यता जाँचते हैं। झिल्लियाँ प्रोब द्वारा संवेदनशील जाँच किए जाने से पहले स्थानांतरण और लोडिंग की जाँच करती हैं। एक ही रंजक दोनों काम करता है, लेकिन उसकी संवेदनशीलता सीमित है, बंधन उत्क्रमणीय है और प्रक्रियाओं का क्रम कड़ाई से पालन करना आवश्यक है।