बायोफिल्म के विरुद्ध मेथिलीन ब्लू: प्रकाश से सक्रिय किए गए प्रयोगशाला अध्ययन क्या मापते हैं

बायोफिल्म तरल में तैरती कोशिकाओं का समूह नहीं है। यह एक संरचना है: सतह से जुड़ी कोशिकाएँ, जो पॉलीसैकराइड, प्रोटीन और कोशिकाबाह्य DNA से बने अपने ही मैट्रिक्स में समाई होती हैं। इसमें बाहर से भीतर की ओर ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की सांद्रता बदलती जाती है। इसी संरचना के कारण कोई यौगिक, जो निलंबित बैक्टीरिया को मिनटों में मार देता है, उन्हीं जीवों के बायोफिल्म के रूप में बढ़ने पर विफल हो सकता है। मेथिलीन ब्लू और बायोफिल्म के बारे में किसी भी दावे को इस संरचना के संदर्भ में पढ़ना आवश्यक है, क्योंकि मैट्रिक्स तय करता है कि कोशिकाओं तक कितना रंजक पहुँचता है और रंजक तक कितना प्रकाश पहुँचता है।

यह समीक्षा ठीक तीन स्रोतों को शामिल करती है। एक पृष्ठभूमि के लिए है। दो प्रयोगशाला प्रयोग हैं। इन भूमिकाओं को अलग रखना ही इस समीक्षा की पूरी पद्धति है। इससे इस विषय की सबसे आम त्रुटि से बचा जा सकता है: प्रयोगशाला की डिश में मिले परिणाम को ऐसे उद्धृत करना मानो वह किसी व्यक्ति में संक्रमण के उपचार का साक्ष्य हो।

पृष्ठभूमि का स्रोत रसायन विज्ञान के बारे में है, सूक्ष्मजीवों को मारने के बारे में नहीं

इन तीनों में सबसे पुराना स्रोत 2005 में प्रकाशित फेनोथियाज़िनियम प्रकाशसंवेदीकारकों के विकास की एक वर्णनात्मक समीक्षा है। यह मेथिलीन ब्लू की यात्रा का वर्णन करती है: 19वीं शताब्दी के एक रंजक से कैंसर की फोटोडायनामिक चिकित्सा और बाद में फोटोडायनामिक रोगाणुरोधी कीमोथेरेपी के लिए एक प्रमुख यौगिक तक। इसका योगदान संरचना और सक्रियता के संबंध का विवरण है: क्रोमोफोर का मिथाइलेशन लिपोफिलिकता, सिंगलेट ऑक्सीजन की उपज और प्रकाश-प्रेरित जीवाणुनाशक क्षमता बढ़ाता है, जबकि कम सक्रिय ल्यूको रूप में अपचयन को धीमा करता है। यह समीक्षा क्षेत्र की समस्या भी स्पष्ट रूप से बताती है। अधिकांश रिपोर्टों में मानक व्यावसायिक रंजकों का उपयोग हुआ था, जबकि व्युत्पन्न यौगिकों के विकास पर अपेक्षाकृत कम काम हुआ था।

अपने वैचारिक मॉडल में क्रियाविधि को समझने के लिए इस समीक्षा का उपयोग करें: प्रकाश रंजक को उत्तेजित करता है; ट्रिपलेट अवस्था Type II ऊर्जा अंतरण के माध्यम से ऑक्सीजन के साथ क्रिया करके सिंगलेट ऑक्सीजन बनाती है, या Type I इलेक्ट्रॉन अंतरण के माध्यम से मुक्त मूलक बनाती है। इस बहुकारकीय आक्रमण के कारण ही पारंपरिक प्रतिरोध तंत्र फोटोडायनामिक विधि से सूक्ष्मजीवों को मारने के विरुद्ध कम प्रभावी होते हैं। लॉग कमी के लिए इसे उद्धृत न करें। इसने ऐसी कोई कमी मापी ही नहीं थी। इस क्रियाविधि के पीछे का व्यापक प्रकाश रसायन फोटोडायनामिक चिकित्सा के साक्ष्य संग्रह में बताया गया है। किसी दिए गए लैम्प से यह प्रक्रिया चल सकती है या नहीं, यह तय करने वाले तरंगदैर्ध्य संबंधी नियम मेथिलीन ब्लू लाल प्रकाश को कैसे अवशोषित करता है में दिए गए हैं।

बायोफिल्म के दो प्रयोग, परिणाम की दो अलग अवधारणाएँ

दोनों प्रयोगात्मक शोधपत्र 660 nm पर मुख की बायोफिल्म में मेथिलीन ब्लू की फोटोडायनामिक क्रिया जाँचते हैं, लेकिन इसके अलावा लगभग किसी बात में समान नहीं हैं। अलग सूक्ष्मजीवी समुदाय, अलग आयु, रंजक के अलग फ़ॉर्मुलेशन, प्रकाश की अलग खुराकें और सबसे बढ़कर अलग परिणाम-माप। यही अंतर इस लेख का मुख्य विषय है और नीचे दी गई मूल तुलनात्मक सामग्री का आधार भी है।

पहला 2024 में प्रकाशित परिपक्व, बहुप्रजातीय, मसूड़े के नीचे की बायोफिल्म का एक इन विट्रो अध्ययन है। Calgary Biofilm Device में पॉलीस्टाइरीन पिनों पर तैंतीस प्रजातियों को एक साथ उगाया गया। अवायवीय परिस्थितियों में पोषण दिया गया, 72 घंटे बाद माध्यम बदला गया और वृद्धि की निर्धारित अवधि 7 दिन तक रखी गई। उपचार में 0.01 प्रतिशत मुक्त मेथिलीन ब्लू और 660 nm की लाल LED का उपयोग हुआ। LED की विकिरण तीव्रता लगभग 330 mW प्रति वर्ग cm थी, दूरी 2 mm और प्रकाश देने की अवधि 5 मिनट थी। इन मानों का गुणन करने पर ऊर्जा लगभग 99 J प्रति वर्ग cm होती है। प्रयोग की रूपरेखा स्पष्ट फैक्टोरियल थी, जिसमें चार समूह थे: अनुपचारित नियंत्रण, प्रकाश के बिना रंजक, रंजक के बिना प्रकाश और रंजक के साथ प्रकाश।

दूसरा 2021 में प्रकाशित प्रारंभिक उपनिवेशन करने वाले सूक्ष्मजीवों की मुख बायोफिल्म का एक इन विट्रो अध्ययन है। Streptococcus की चार प्रजातियों को 1 प्रतिशत सुक्रोज़ के साथ 96 वेल वाली प्लेटों में 24 घंटे तक एक साथ उगाया गया। प्रकाशसंवेदीकारक 4.65 माइक्रोमोलर मेथिलीन ब्लू था, जिसे बीटा साइक्लोडेक्स्ट्रिन नैनोकणों से जोड़ा गया था। इस वितरण फ़ॉर्मुलेशन का उद्देश्य रंजक को बायोफिल्म की बाधाओं के पार पहुँचाना था। दोनों प्रकाश स्रोत 660 nm पर लाल प्रकाश देते थे और प्रकाश देने की अवधि 90 सेकंड थी, लेकिन उनकी खुराकों में बहुत अंतर था: लेज़र समूह में 320 J प्रति वर्ग cm और LED समूह में 8.1 J प्रति वर्ग cm। नियंत्रणों में प्रकाश के बिना रंजक, केवल लेज़र, केवल LED, ऋणात्मक नियंत्रण के रूप में सलाइन और रोगाणुरोधी तुलना-मानक के रूप में 0.2 प्रतिशत क्लोरहेक्सिडीन शामिल थे।

7 दिन पुराना, 33 प्रजातियों वाला अवायवीय समुदाय और 24 घंटे पुरानी, 4 प्रजातियों वाले प्रारंभिक उपनिवेशकों की बायोफिल्म अलग मापन प्रणालियाँ हैं। आगे दी गई संख्याओं का औसत नहीं निकाला जा सकता।

प्रत्येक अध्ययन ने वास्तव में क्या मापा

परिपक्व बायोफिल्म के अध्ययन में परिणाम-माप थे: TTC अपचयन के माध्यम से चयापचय गतिविधि, जिसे 485 nm पर पढ़ा गया, और 33 प्रजातियों के प्रोब के साथ चेकरबोर्ड DNA-DNA संकरण के माध्यम से बैक्टीरिया की मात्रा। पहचान सीमा लगभग 10,000 कोशिकाएँ थी। जीवित सूक्ष्मजीवों की संख्या के लिए प्लेटिंग, क्रिस्टल वायलेट से जैवभार मापन, जीवित-मृत कोशिकाओं का इमेजिंग या दोबारा वृद्धि का अनुवर्ती परीक्षण नहीं किया गया। केवल LED ने LED रहित समूहों की तुलना में चयापचय गतिविधि लगभग 50 प्रतिशत घटाई, और रंजक के साथ LED ने इसे लगभग 55 प्रतिशत घटाया। केवल रंजक वाला समूह सांख्यिकीय रूप से अनुपचारित नियंत्रण के समान समूह में रहा। DNA से प्राप्त गणना में केवल रंजक, केवल LED और रंजक के साथ LED, तीनों के मान नियंत्रण से सांख्यिकीय रूप से सार्थक स्तर तक कम थे, लेकिन इन तीनों के बीच कोई सार्थक अंतर नहीं था। लेखक इसका निष्कर्ष सीधे बताते हैं: उपचारों ने पहले से स्थापित, सतह से जुड़ी बहुसूक्ष्मजीवी बायोफिल्म को नष्ट नहीं किया। परिपक्व पीरियोडॉन्टल बायोफिल्म की संरचना को यांत्रिक रूप से तोड़ना आवश्यक है, और फोटोडायनामिक विधि अधिकतम एक सहायक उपाय हो सकती है।

प्रारंभिक उपनिवेशकों के अध्ययन में परिणाम-माप चयनात्मक संवर्धन माध्यमों पर प्राप्त जीवित सूक्ष्मजीवों की संख्या थी, जिसे लघुगणकीय पैमाने पर व्यक्त किया गया। प्रकाश के बिना रंजक वाले समूह में सलाइन से कोई अंतर नहीं था। प्रकाश से सक्रिय दोनों समूहों, लेज़र के साथ नैनोकणों में समाहित रंजक और LED के साथ नैनोकणों में समाहित रंजक, ने ऋणात्मक नियंत्रण की तुलना में जीवित सूक्ष्मजीवों की संख्या लगभग 4 लॉग तक घटाई। इस माप पर यह 10,000 गुना या 99.99 प्रतिशत कमी थी। दोनों में से किसी का भी क्लोरहेक्सिडीन से सांख्यिकीय अंतर नहीं था। केवल प्रकाश और केवल अंधकार की परिस्थितियों के मान अलग, विश्वसनीय लॉग संख्याओं के रूप में रिपोर्ट नहीं किए गए थे। इसलिए ईमानदार सार वही है जिसका शोधपत्र समर्थन करता है: प्रकाश से सक्रिय, नैनोकणों में समाहित रंजक ने कमी उत्पन्न की, अंधकार में रंजक ने नहीं, और इस युवा बायोफिल्म मॉडल में कमी का परिमाण एंटीसेप्टिक तुलना-मानक के बराबर था।

किसी भी शोधपत्र ने उपचार के बाद दोबारा वृद्धि, अवशिष्ट जैवभार या मैट्रिक्स की संरचना नहीं मापी। CFU में कमी बचे हुए मैट्रिक्स के बारे में कुछ नहीं बताती। चयापचय में गिरावट जीवित बचे सूक्ष्मजीवों के बारे में कुछ नहीं बताती। DNA की गणना यह नहीं बता सकती कि कौन जीवित है।

परीक्षण और परिणाम-माप की तुलना

यह तालिका इस लेख की तुलनात्मक सामग्री है। किसी पंक्ति में बाएँ से दाएँ पढ़कर देखें कि एक अध्ययन क्या सिद्ध करता है। किसी स्तंभ में ऊपर से नीचे पढ़कर देखें कि किन प्रश्नों का उत्तर दोनों में से कोई अध्ययन नहीं देता।

तीन अंतर विशेष ध्यान देने योग्य हैं। पहला, परिपक्व मॉडल में केवल प्रकाश वाला समूह लगभग पूरे चयापचय प्रभाव को समझाता है, इसलिए 55 प्रतिशत का आँकड़ा रंजक के माध्यम से सूक्ष्मजीवों को मारने का माप नहीं है। दूसरा, युवा मॉडल में अंधकार में फ़ॉर्मुलेशन निष्क्रिय है और प्रभाव केवल प्रकाश के साथ दिखाई देता है, जो प्रकाश-सक्रियण का संकेत है। तीसरा, DNA से प्राप्त गणना में 80 प्रतिशत की गिरावट गणितीय रूप से लगभग 0.7 लॉग के निकट तभी होती यदि मापा गया चर जीवित सूक्ष्मजीवों की संख्या होता। यहाँ ऐसा नहीं है, इसलिए इसे कभी भी लॉग स्तर पर सूक्ष्मजीवों को मारने के आँकड़े के रूप में उद्धृत नहीं करना चाहिए। दंत बायोफिल्म से संबंधित संदर्भ मुख की बायोफिल्म और दंत अनुसंधान के संग्रह में दिए गए हैं। अलग-अलग अध्ययनों में मॉडल, प्रशासन मार्ग और परिणाम-माप अलग करके समझने की सामान्य पद्धति प्रयोगशाला विधियों की मार्गदर्शिका में विस्तार से दी गई है।

बायोफिल्म अध्ययनों को पढ़ने के लिए अलग नियम क्यों आवश्यक हैं

चार चर तय करते हैं कि मेथिलीन ब्लू की बायोफिल्म संबंधी किसी खोज का अर्थ उसकी अपनी प्रयोगशाला प्लेट से आगे भी है या नहीं।

पहले बायोफिल्म की आयु और मैट्रिक्स आते हैं। पुरानी बायोफिल्म अधिक मोटी होती हैं, उनमें अधिक क्रॉस-लिंक होते हैं और रंजक का उनमें प्रवेश करना अधिक कठिन होता है। 2021 के लेखक रंजक के प्रवेश और संगठित बायोफिल्म में प्रकाश के खराब प्रसार को मुख्य सीमाएँ बताते हैं। साइक्लोडेक्स्ट्रिन में समाहित करने जैसी वाहक रणनीतियाँ इसी सीमा को दूर करने के प्रयास हैं। इसलिए फ़ॉर्मुलेशन एक प्रयोगात्मक चर है, केवल एक विवरण नहीं।

दूसरे स्थान पर खुराक की गणना आती है। यहाँ समान तरंगदैर्ध्य पर फ्लुएंस, यानी प्रति इकाई क्षेत्र दी गई प्रकाश ऊर्जा, 8.1 से 320 J प्रति वर्ग cm तक है, जिसमें लगभग चालीस गुना अंतर है। विकिरण तीव्रता 90 mW से कई W प्रति वर्ग cm तक है। समान तरंगदैर्ध्य का अर्थ समान प्रकाश एक्सपोज़र नहीं है, और किसी भी अध्ययन ने खुराक में इतने व्यवस्थित बदलाव नहीं किए कि खुराक-प्रतिक्रिया वक्र निर्धारित किया जा सके।

तीसरे स्थान पर नियंत्रण आते हैं। अंधकार में रंजक वाला समूह न हो तो अध्ययन रंजक की अंतर्निहित विषाक्तता को खारिज नहीं कर सकता। केवल प्रकाश वाला समूह न हो तो किसी प्रभाव का श्रेय प्रकाश-सक्रियण को नहीं दिया जा सकता। दोनों शोधपत्रों में दोनों नियंत्रण हैं, जो उनकी अच्छी विशेषता है। परिपक्व बायोफिल्म वाला शोधपत्र दिखाता है कि केवल प्रकाश वाला समूह क्यों आवश्यक है: उसके बिना चयापचय परिणाम को रंजक का प्रभाव माना जाता।

चौथे स्थान पर परिणाम-माप आते हैं। जीवित रहने की क्षमता, चयापचय, DNA की मात्रा, जैवभार, संरचना और दोबारा वृद्धि छह अलग दावे हैं। यहाँ कोई भी शोधपत्र दो से अधिक नहीं मापता। विशेष रूप से दोबारा वृद्धि का मापन सभी में अनुपस्थित है, इसलिए प्रभाव के बने रहने को प्रदर्शित नहीं किया गया है; उसे मापा ही नहीं गया है।

संक्रमण के उपचार के बारे में इससे क्या स्थापित नहीं होता

इनमें से किसी भी प्रयोगात्मक व्यवस्था में रक्त परिसंचरण, प्रतिरक्षा कोशिकाएँ, लार का प्रवाह, मसूड़े की खाँच के द्रव का नवीकरण या यांत्रिक डिब्राइडमेंट शामिल नहीं है। किसी वेल में रंजक की सांद्रता मनुष्य में किसी भी प्रशासन मार्ग के बाद ऊतक की सांद्रता नहीं होती। प्रयोगशाला की युवा या परिपक्व बायोफिल्म को एक बार 5 मिनट या 90 सेकंड तक प्रकाश देना उपचार का पूरा क्रम नहीं है। परिपक्व बायोफिल्म के लेखक स्वयं यह बात कहते हैं: वे फोटोडायनामिक विधि को यांत्रिक रूप से हटाने के संभावित सहायक उपाय के रूप में प्रस्तुत करते हैं, स्वतंत्र उन्मूलन विधि के रूप में नहीं।

सही सार सीमित है और उपलब्ध साक्ष्य के अनुरूप है। प्रकाश से सक्रिय मेथिलीन ब्लू प्रयोगशाला में मुख के एक परिपक्व सूक्ष्मजीवी समुदाय को नष्ट किए बिना उसके चयापचय और DNA से प्राप्त मात्रा को घटा सकता है। उस व्यवस्था में चयापचय पर अधिकांश प्रभाव केवल प्रकाश से होता है। साइक्लोडेक्स्ट्रिन के माध्यम से पहुँचाया गया, प्रकाश से सक्रिय रंजक प्रयोगशाला की युवा स्ट्रेप्टोकोकल बायोफिल्म में जीवित सूक्ष्मजीवों की संख्या को परिमाण के कई क्रमों तक घटा सकता है। उसी मॉडल में यह कमी क्लोरहेक्सिडीन के तुलनीय है। इनमें से कोई भी अवलोकन किसी व्यक्ति के संक्रमण पर लागू होता है या नहीं, यह वितरण, प्रकाश की पहुँच, ऑक्सीजन, शरीररचना और नैदानिक परिणाम-मापों पर निर्भर करता है, जिन्हें मापने के लिए ये प्रयोग कभी बनाए ही नहीं गए थे।