EMB अगर पर E. coli और अन्य कॉलोनियों का रूप समझना

एक विद्यार्थी ईओसिन मेथिलीन ब्लू अगर पर एक अज्ञात नमूने की स्ट्रीकिंग करता है, उसे रात भर इनक्यूबेट करता है और लौटने पर प्लेट में हरी झिलमिलाहट वाली गहरे रंग की कॉलोनियाँ देखता है। नोटबुक में वह लिखता है, "E. coli, पुष्टि हुई।" यह प्रविष्टि प्लेट से मिलने वाले प्रमाण से अधिक दावा करती है। प्लेट विशिष्ट परिस्थितियों में वृद्धि और किण्वन का फीनोटाइप दिखाती है। प्रजाति की पहचान एक अलग दावा है, जिसके लिए अलग प्रमाण चाहिए।

यह मार्गदर्शिका EMB अगर के परिणामों को व्याख्या का विषय मानती है। यह अंतर्निहित सिद्धांत समझाती है, नियंत्रणों सहित एक उदाहरणात्मक प्लेट एटलस प्रस्तुत करती है और उन स्थितियों की पहचान करती है जहाँ पाठ्यपुस्तक का चित्र भ्रामक हो सकता है।

प्लेट के पीछे का सिद्धांत

EMB अगर चयनात्मक और विभेदक, दोनों है। ईओसिन Y और मेथिलीन ब्लू रंजक अनेक ग्राम-पॉज़िटिव जीवों को दबाते हैं, इसलिए यह माध्यम ग्राम-नेगेटिव वृद्धि को अनुकूलता देता है। यही रंजक संकेतकों की तरह भी काम करते हैं: जब कोई जीव उपलब्ध शर्करा का किण्वन करके आसपास पर्याप्त अम्ल पैदा करता है, तो कॉलोनी बड़ी मात्रा में रंजक ग्रहण करती है और गहरे बैंगनी से नीले-काले रंग की हो जाती है। तीव्र अम्ल उत्पादन होने पर कॉलोनी की सतह धात्विक हरी इंद्रधनुषी चमक दिखा सकती है। ईओसिन मेथिलीन ब्लू अगर प्लेटों के लिए ASM प्रोटोकॉल चयन और विभेदन के इस संयोजन का वर्णन करता है और शिक्षण के लिए संदर्भ तस्वीरें उपलब्ध कराता है।

किसी भी परिणाम को समझने से पहले एक बात महत्त्वपूर्ण है: जाँचें कि कौन-सा संघटन इस्तेमाल हो रहा है। पुराने Holt Harris Teague संघटन में लैक्टोज़ और सुक्रोज़ दोनों होते हैं, जबकि Levine EMB में केवल लैक्टोज़ होता है। सुक्रोज़ का किण्वन करने वाला, लेकिन लैक्टोज़ का किण्वन न करने वाला जीव, जैसे Serratia marcescens के अनेक आइसोलेट, दोनों संस्करणों पर अलग दिख सकता है। EMB माध्यमों के लिए निर्माता के दस्तावेज़ संघटन के इस अंतर को स्पष्ट रूप से बताते हैं। परिणाम के साथ नोटबुक में निर्माता और संघटन भी दर्ज करें।

तैयार, अनिनोकुलेटेड EMB अगर सामान्यतः लाल-भूरे से लाल-बैंगनी रंग का होता है; कभी-कभी उसमें हरापन या महीन अवक्षेप दिखता है। यह पृष्ठभूमि का रंग है, वृद्धि नहीं। हर अवलोकन की तुलना किसी अनिनोकुलेटेड प्लेट या दर्ज आधारभूत स्थिति से करें, और प्राथमिक प्लेट को 35 से 37 C पर लगभग 18 से 24 घंटे के वायवीय इनक्यूबेशन के बाद पढ़ें, जब तक शिक्षण प्रोटोकॉल में कुछ और न बताया गया हो। लंबे इनक्यूबेशन से किण्वन का दृश्य रूप बदल सकता है।

प्लेट को कैसे देखें

दो प्रकार के प्रकाश का उपयोग करें। पहले प्लेट को परावर्तित या तिरछे प्रकाश में देखें और झुकाएँ: धात्विक चमक इंद्रधनुषी होती है और देखने के कोण के साथ दिखाई दे सकती है या गायब हो सकती है। फिर कॉलोनी का रंग और उसके गहरे केंद्र जाँचने के लिए पारगमित प्रकाश में देखें। अच्छी तरह अलग-अलग स्थित कॉलोनियों का उपयोग करें, क्योंकि भीड़ और पड़ोसी कॉलोनियाँ आसपास अम्ल के संचय को बदलती हैं और रंग को दबा सकती हैं या अधिक गहरा कर सकती हैं। ASM का चित्र संग्रह इसे सीधे दिखाता है: मिश्रित कल्चर में E. coli की अपेक्षित चमक गायब हो सकती है, क्योंकि आसपास के जीव अम्लीय परिवेश को बदल देते हैं।

जब भी अभ्यास में संभव हो, नियंत्रण शामिल करें। शिक्षण में आम तौर पर नीले-काले रंग और धात्विक चमक वाले फीनोटाइप के लिए E. coli ATCC 25922, रंगहीन फीनोटाइप के लिए Salmonella Typhimurium ATCC 14028 या Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 जैसा अकिण्वक, और अवरोधन नियंत्रण के लिए Enterococcus faecalis या Staphylococcus aureus जैसा ग्राम-पॉज़िटिव जीव इस्तेमाल किया जाता है, जैसा कि EMB माध्यमों की मानक गुणवत्ता नियंत्रण तालिकाओं में दिया गया है। यदि सकारात्मक नियंत्रण में चमक न हो, तो अज्ञात नमूने पर संदेह करने से पहले इनक्यूबेशन, कॉलोनियों की भीड़ या संघटन पर संदेह करें।

उदाहरणात्मक प्लेट एटलस

नीचे दी गई प्लेटें निर्मित चित्रण हैं, वास्तविक कल्चर की तस्वीरें नहीं। ये उस पैटर्न को दिखाती हैं जिसे खोजना चाहिए, किसी एक स्ट्रेन की सटीक रंगत को नहीं। इनकी तुलना ASM की संदर्भ तस्वीरों और शिक्षण प्रयोगशाला की वास्तविक प्लेटों से करें।

प्लेट 1: EMB अगर पर Escherichia coli, तीव्र लैक्टोज़ किण्वक

EMB अगर पर E. coli सामान्यतः गहरे बैंगनी से नीले-काले रंग का होता है; तीव्र अम्ल उत्पादन के कारण अक्सर उसका केंद्र गहरा होता है और धात्विक हरी चमक दिखाई देती है। यही चमक वह प्रसिद्ध विशेषता है जिसे विद्यार्थी खोजते हैं, लेकिन इसे परिभाषा नहीं, सहायक प्रमाण मानें। चमक की तीव्रता स्ट्रेन, इनक्यूबेशन समय, कॉलोनी घनत्व और देखने के कोण के साथ बदलती है। चमक न होने से E. coli की संभावना समाप्त नहीं होती, और बिना चमक वाली गहरे रंग की कॉलोनी कई अन्य किण्वकों की ओर भी संकेत करती है। आगे के किसी भी काम के लिए भीड़ वाले क्षेत्र से निष्कर्ष निकालने के बजाय अच्छी तरह अलग स्थित कॉलोनी चुनें।

प्लेट 2: EMB अगर पर Klebsiella pneumoniae, श्लेष्माभ किण्वक

EMB अगर पर Klebsiella pneumoniae सामान्यतः गुलाबी-बैंगनी से भूरे-बैंगनी रंग की बड़ी, चमकदार, श्लेष्माभ कॉलोनियाँ बनाता है। इनके केंद्र अक्सर गहरे होते हैं, लेकिन सामान्यतः इनमें तेज़ धात्विक चमक नहीं होती। Enterobacter जैसे संबंधित किण्वकों में भी ऐसी आकृति मिलती है। श्लेष्माभ बनावट और कॉलोनी का आकार अवलोकन का हिस्सा हैं: छोटी और सपाट गुलाबी कॉलोनी का संकेत बड़ी, गुंबदाकार श्लेष्माभ कॉलोनी से अलग होता है। E. coli की तरह यहाँ भी प्लेट एक किण्वन फीनोटाइप का संकेत देती है, और प्रजाति-स्तर पर नाम देने के लिए नीचे वर्णित जैवरासायनिक पुष्टि आवश्यक है।

प्लेट 3: EMB अगर पर Salmonella और अन्य अकिण्वक, रंगहीन कॉलोनियाँ

EMB अगर पर Salmonella और लैक्टोज़ का किण्वन न करने वाले संबंधित जीव, जिनमें Shigella और अनेक Pseudomonas आइसोलेट शामिल हैं, सामान्यतः रंगहीन से अर्धपारदर्शी या हल्के अंबर रंग की कॉलोनियों के रूप में बढ़ते हैं। कुछ संघटनों और परिस्थितियों में हल्की गुलाबी आभा दिखाई देती है, इसलिए हल्की गुलाबी कॉलोनी अपने-आप किण्वक नहीं मानी जा सकती। EMB, Salmonella को Shigella या अन्य अकिण्वकों से अलग नहीं कर सकता; यह अंतर बाद के परीक्षणों से निर्धारित होता है। यह भी ध्यान दें कि लैक्टोज़-पॉज़िटिव Salmonella स्ट्रेन में E. coli जैसी धात्विक कॉलोनियाँ दर्ज की गई हैं। यह एक और कारण है कि अकेली प्लेट से अंतिम निष्कर्ष नहीं निकाला जा सकता।

प्लेट 4: Serratia marcescens और संघटन से पैदा होने वाला भ्रम

Serratia marcescens के लिए अलग खंड आवश्यक है, क्योंकि विद्यार्थी अक्सर लाल कॉलोनियों की अपेक्षा करते हैं और फिर प्लेट को गलत समझ लेते हैं। अधिकांश नैदानिक आइसोलेट लैक्टोज़ का किण्वन नहीं करते, इसलिए Levine EMB पर वे आम तौर पर फीके या बहुत हल्के रंग के दिखाई देते हैं। चूँकि अनेक आइसोलेट सुक्रोज़ का किण्वन करते हैं, सुक्रोज़ वाला संघटन अधिक गहरी या अम्ल से अधिक जुड़ी प्रतिक्रिया दे सकता है। 35 से 37 C पर विशिष्ट लाल प्रोडिजियोसिन वर्णक की भी अपेक्षा न करें; इनक्यूबेटर के तापमान पर वर्णक उत्पादन भरोसेमंद नहीं होता। जब प्रोटोकॉल में EMB अगर पर Serratia marcescens का उल्लेख हो, तो जाँचें कि वह कथन किस संघटन को आधार मानता है। Serratia के चयापचय की एक समीक्षा इस भ्रम के पीछे के लैक्टोज़-नेगेटिव और सुक्रोज़ के प्रति परिवर्तनशील पैटर्न का सार प्रस्तुत करती है।

प्लेट 5: नियंत्रण और अवरुद्ध जीव

Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus और Bacillus जैसे ग्राम-पॉज़िटिव जीव सामान्यतः EMB अगर पर अवरुद्ध होते हैं या उनकी वृद्धि काफी दब जाती है, हालाँकि हर स्ट्रेन में अवरोधन पूर्ण नहीं होता। नियंत्रणों का समूह अवलोकन को विश्वसनीय बनाता है: E. coli नियंत्रण में नीले-काले रंग और चमक के साथ अच्छी वृद्धि होनी चाहिए, अकिण्वक नियंत्रण में रंगहीन वृद्धि होनी चाहिए और अवरोधन नियंत्रण में बहुत कम या कोई वृद्धि नहीं होनी चाहिए। यदि अवरोधन नियंत्रण में अच्छी वृद्धि हो, तो चयनात्मक चरण विफल हुआ है और उस बैच के अन्य सभी अवलोकन संदिग्ध हैं। रंजन विधियाँ कल्चर माध्यमों से अलग प्रश्न का उत्तर देती हैं; प्रयोगशाला में स्लाइड रंजन के पहलू के लिए मेथिलीन ब्लू रंजन एटलस देखें।

सीमाओं सहित तुलना

तीन वाक्य भ्रामक रूपों का सार बताते हैं। गहरा रंग E. coli के बराबर नहीं है, क्योंकि Klebsiella, Enterobacter और अन्य किण्वक बिना चमक के गहरे केंद्र विकसित करते हैं। गुलाबी रंग Klebsiella के बराबर नहीं है, क्योंकि मध्यम या धीमे किण्वक और अकिण्वक माने जाने वाले कुछ जीव गुलाबी या हल्के बैंगनी दिखते हैं। चमक E. coli की निश्चित पहचान के बराबर नहीं है, क्योंकि अन्य तीव्र किण्वक भी इसे पैदा कर सकते हैं। शिक्षण प्रोटोकॉल और उसके मिश्रित कल्चर के चित्र इन सभी सीमाओं को दर्शाते हैं।

पुष्टि की सीमाएँ

EMB अगर फीनोटाइप बताता है, प्रजाति नहीं। अलग-अलग जीवों की कॉलोनियाँ एक जैसी दिख सकती हैं, और एक ही जीव स्ट्रेन, उम्र, भीड़, संघटन तथा इनक्यूबेशन के कारण पाठ्यपुस्तक में बताए रूप से अलग दिख सकता है। इसीलिए शिक्षण और नैदानिक कार्यप्रवाह EMB की कॉलोनी आकृति को प्रारंभिक संकेत मानते हैं।

विद्यार्थी के लिए प्रमाण-आधारित कार्यप्रवाह यह है: अलग स्थित कॉलोनी का वर्णन करें—आकार, रंग, केंद्र, तिरछे प्रकाश में चमक और श्लेष्माभ गुण—तथा संघटन, इनक्यूबेशन समय और तापमान एवं नियंत्रण दर्ज करें; फिर किसी भी पुष्टि परीक्षण से पहले अच्छी तरह अलग स्थित कॉलोनी का उपकल्चर करके शुद्ध कल्चर प्राप्त करें। आगे के सामान्य परीक्षणों में संभावित E. coli और कोलिफॉर्म की पहचान के लिए ग्राम रंजन के साथ IMViC प्रतिक्रियाएँ, आंत्रीय जीवों के लिए TSI या KIA और जीव-विशिष्ट जैवरासायनिक परीक्षण समूह शामिल हैं। जहाँ कार्य में आवश्यकता हो, वहाँ सीरोलॉजिकल, MALDI TOF या अन्य मान्य पहचान विधियाँ इस्तेमाल की जाती हैं। चयनात्मक और विभेदक आंत्रीय माध्यमों में EMB की भूमिका की पृष्ठभूमि के लिए आंत्रीय कल्चर माध्यमों के परिचय और ग्राम रंजन से आगे की जाँच देखें। नीला स्लाइड रंजन क्या सिद्ध कर सकता है और क्या नहीं, इस संबंधित प्रश्न के लिए मेथिलीन ब्लू रंजन एटलस भी इसी दृष्टिकोण से अवलोकन और निष्कर्ष को अलग रखता है।

निष्कर्ष से पहले अवलोकन लिखें। "24 घंटे पर Levine EMB में गहरी नीली-काली कॉलोनियाँ, जिनमें कोण पर निर्भर हरी चमक है, तीव्र लैक्टोज़ किण्वन के अनुरूप" लिखना प्रमाण-आधारित है। "E. coli, पुष्टि हुई" लिखने के लिए उस पुष्टि चरण की आवश्यकता है जिसे अकेली प्लेट पूरा नहीं कर सकती।