מתילן כחול וחשיפה לאור: אורך גל, צפיפות הספק הקרינה וגאומטריית הטיפול

שני מאמרים מדווחים על חשיפת מתילן כחול למנת אור של 10 J לסנטימטר רבוע. באחד, החשיפה הורגת חיידקים. בשני, היא אינה גורמת לשינוי מדיד. קורא שמשווה רק את המנה מסיק שהתחום אינו עקבי. התחום עקבי. המנה מעולם לא תיארה את החשיפה כולה.

חשיפה לאור היא מערכת קטנה של פרמטרים הפועלים יחד: אורך גל, צפיפות הספק הקרינה, משך החשיפה, הפלואנס המתקבל, זמינות החמצן, ריכוז הצבע ומצב האגרגציה שלו, התזמון בין מתן הצבע להארה, והדרך האופטית שהאור עובר בפועל בתוך הדגימה. שינוי של אחד מהם משנה את הפוטוכימיה. מאמר זה עובר על כל פרמטר, ולאחר מכן מבחין בין פוטוביומודולציה באור תת־אדום קרוב לבין הפעלה ישירה של הצבע באור, משום שאלו שני אופני הפעולה שביניהם נוצר הבלבול השכיח ביותר.

אורך הגל קובע אם הצבע משתתף בתהליך

מתילן כחול במים בולע אור אדום בעוצמה כשהוא בצורת מונומר, עם שיא סמוך ל־664 עד 665 nm וכתף בספקטרום באורך גל קצר יותר, סמוך ל־610 nm, שגדלה כאשר הצבע מתאגד לדימרים ולצברים גדולים יותר. מקדם הבליעה המולרי סמוך לשיא הוא בסדר גודל של 65,000 עד 85,000 M-1 cm-1, כך שגם לתמיסות בריכוז מיקרומולרי כבר יש צבע כחול עז. הסקירה הפוטוכימית המוקדמת של מתילן כחול עם DNA ומצעים ביולוגיים מתעדת את התנהגות הבליעה הזאת ואת הכימיה של המצב המעורר שבאה בעקבותיה: הבליעה מאכלסת מצב סינגלט קצר־חיים, שממנו מתרחש מעבר למצב טריפלט ארוך־חיים יותר, עם נצילויות מדווחות הקרובות ל־0.5. בתמיסה מאווררת, החמצן מכבה את מצב הטריפלט בתוך כ־2 מיקרושניות.

שלב הכיבוי הזה הוא הנקודה שבה שני המסלולים הפוטוכימיים מתפצלים. בכימיה מסוג II, הצבע במצב טריפלט מעביר אנרגיה לחמצן במצב היסוד ומייצר חמצן סינגלט, עם נצילויות המצוטטות בדרך כלל סביב 0.52. בכימיה מסוג I, הטריפלט מעביר במקום זאת אלקטרון או מימן למצע, וכך נוצרים רדיקלים, ובהם סופראוקסיד וצורוני הידרוקסיל. שני המסלולים יכולים לפעול בו־זמנית, וההשפעה הפוטודינמית המקובלת נותרת תלויה מאוד בחמצן גם כאשר מסלול מסוג I תורם לה.

מכאן נובע כלל פשוט לבחירת אורך הגל עבור מתילן כחול. אור אדום בטווח של כ־630 עד 680 nm חופף לפס הבליעה של הצבע, כאשר 660 עד 665 nm קרובים לשיא הבליעה של המונומר, ולכן הוא יכול להניע כימיה המבוססת על חומר מרגש־אור בכל מקום שבו יש כמות משמעותית של הצבע. אור תת־אדום קרוב באורך גל של 810 nm נמצא הרחק מחוץ לפס הבליעה של מצב היסוד, ולכן אינו מתאים לעירור ישיר של הצבע. הריכוז מסבך את התמונה באופן ברור אחד: ככל שהריכוז עולה, חלק גדול יותר מהצבע נמצא בצורות דימריות ובצברים, הבולעים לכיוון 610 nm ומעוררים תגובות באור ביעילות נמוכה יותר לכל מולקולה. לכן הכפלת כמות הצבע אינה מכפילה את ההשפעה. הסקירה הנלווית על מתילן כחול וטיפול באור אדום מתייחסת לכלל הבליעה הזה כתנאי מקדים לכל תגובה המתווכת באמצעות חומר מרגש־אור.

צפיפות הספק הקרינה, משך החשיפה ופלואנס הם שלושה פרמטרים, לא אחד

פלואנס, הנמדד ב־J לסנטימטר רבוע, הוא צפיפות הספק הקרינה כפול הזמן. דיווח על הפלואנס בלבד מסתיר את הקצב שבו האנרגיה הגיעה, והקצב חשוב.

צפיפות הספק קרינה גבוהה למשך זמן קצר וצפיפות הספק קרינה נמוכה למשך זמן ארוך יכולות להניב אותו פלואנס, אך כימיה שונה. צפיפות הספק קרינה גבוהה צורכת את החמצן המומס מהר יותר מכפי שהדיפוזיה מחזירה אותו, וכך מגבילה את המסלול מסוג II התלוי בחמצן במהלך החשיפה. היא גם מעבירה חום, ורקמה מגיבה לחימום בשינויים בזרימת הדם, המשנים הן את החמצון והן את פיזור הצבע. צפיפות הספק קרינה נמוכה לאורך חשיפה ממושכת שומרת על אספקת החמצן, אך גם נותנת לתהליכי תיקון וחמצון מחדש זמן לפעול במהלך החשיפה עצמה. ספרי לימוד בפוטוכימיה מכנים את ההנחה שרק המנה הכוללת חשובה עקרון ההדדיות. העיקרון אינו תקף כאשר חמצן, חימום או תהליכים ביולוגיים משתתפים, וברקמה זה קורה כמעט תמיד.

בחשיפות פוטודינמיות אנטימיקרוביאליות בבני אדם עם מתילן כחול משתמשים בדרך כלל ב־6 עד 18 J לסנטימטר רבוע, טווח החופף לערכים של פוטוביומודולציה. לכן הפלואנס לבדו אינו יכול לזהות את אופן הפעולה. חשיפה של 10 J לסנטימטר רבוע באורך גל של 660 nm ברקמה המכילה צבע היא פוטוכימיה המונעת באמצעות חומר מרגש־אור. אותו פלואנס באורך גל של 810 nm ברקמה המכילה עקבות צבע הוא דבר אחר לגמרי. המספר זהה. המושג שונה.

הדרך האופטית וגאומטריית הדגימה קובעות מה האור פוגש

התנהגות לפי חוק בר–למברט פירושה שחזית הדגימה מקבלת הרבה יותר אור מחלקה האחורי. בקיווטה המכילה צבע בריכוז של עשרות מיקרומולר, המילימטר הראשון יכול לבלוע את רוב האור האדום הפוגע בדגימה, ולהותיר את השכבות העמוקות יותר למעשה ללא חשיפה. אם מעבירים את אותה תמיסה לבארית רדודה בנפח קטן, החשיפה נעשית כמעט אחידה. אותו צבע, אותה מנורה, אותו פלואנס על פני השטח, תוצאה שונה.

ברקמה נוסף פיזור לבליעה. אור אדום סמוך ל־660 nm חודר לעומק בסדר גודל של מילימטרים, כאשר העומק המדויק נקבע לפי תכולת הדם, הפיגמנטציה וסוג הרקמה. באריות מוסיפות ארטיפקטים משלהן: אפקט עדשה של המניסקוס, החזרה מהדפנות, הצללה של באריות בקצוות והתחממות של נפחים קטנים מתחת למקור האור. שתי מעבדות המדווחות על הגדרות מנורה זהות, אך משתמשות בסוגי פלטות, בנפחים או במרחקים ממקור האור שונים, ערכו ניסויים שונים.

המרחק ראוי להדגשה משום שהוא המשתנה הסמוי השכיח ביותר. צפיפות הספק הקרינה יורדת במהירות עם המרחק ממקור שאינו מפיק אלומה מקבילית, ולכן העברת מנורה מגובה של 2 cm לגובה של 5 cm מעל הפלטה יכולה להפחית את צפיפות הספק הקרינה פי כמה, אף שסעיף השיטות עדיין מתאר את אותו הדבר. ללא מדידה של צפיפות הספק הקרינה על פני הדגימה, ערכי פלואנס שפורסמו וחושבו מתוך נתוני ההספק של היצרן הם אומדנים, לא מדידות.

מדריך פרמטרים מוער: מה הופך חשיפה לניתנת לשחזור

הכלי המקורי בעמוד זה הוא רשימת בדיקה. חשיפה לאור במחקר שאינה כוללת את הפרטים האלה אינה ניתנת להשוואה לחשיפה אחרת, גם אם המנה המוצהרת נראית דומה מאוד.

1. אורך גל ורוחב פס. השיא והרוחב המלא, לא שם של צבע. LED אדום מכסה 630 עד 680 nm, טווח שבו בליעת הצבע משתנה מאוד.
2. צפיפות הספק הקרינה על פני הדגימה, כפי שנמדדה, ב־mW לסנטימטר רבוע. ההספק בוואטים שמציין היצרן אינו צפיפות הספק הקרינה.
3. משך החשיפה ופעימות. הארה רציפה לעומת הארה בפעימות, כולל תדירות הפעימות ומחזור העבודה, כאשר רלוונטי.
4. פלואנס המחושב מתוך צמד הערכים שנמדדו לעיל, ב־J לסנטימטר רבוע.
5. ריכוז הצבע, הפורמולציה ומצב האגרגציה. מונומר סמוך ל־664 nm מעורר תגובות באור באופן שונה מצברים סמוך ל־610 nm.
6. מרווח הזמן בין מתן הצבע להארה. דקות עד שעות בין מתן הצבע להקרנה, הקובעות היכן נמצא הצבע כשהאור מגיע.
7. חמצון. תמיסה מאווררת לעומת רקמה היפוקסית משנה ישירות את האיזון בין מסלול מסוג I למסלול מסוג II.
8. גאומטריה. עומק הדגימה, נפח, סוג כלי, מרחק מקור האור וזוויתו, ועומק המטרה ברקמה.

הרגל שימושי בקריאת מאמרים: בדקו תחילה את מרווח הזמן בין מתן הצבע להארה. הוא חושף את הכוונה. במערכי מחקר פוטודינמיים מקרינים במכוון רקמה המכילה צבע. מערכי מחקר משולבים עשויים להפריד במכוון בין השניים, כפי שמתואר להלן.

פוטוביומודולציה באור תת־אדום קרוב אינה הפעלה של הצבע באור

פוטוביומודולציה, המקוצרת בדרך כלל ל־PBM, משתמשת באור אדום או תת־אדום קרוב כדי לווסת איתות פנימי בגוף בלי להוסיף חומר מרגש־אור. טיפול פוטודינמי, המקוצר בדרך כלל ל־PDT, משתמש בשלושה מרכיבים יחד: אור שהחומר המרגש בולע, החומר המרגש עצמו וחמצן, כדי ליצור פרץ של צורונים תגובתיים הפוגע במטרה. סקירה על מיטוכונדריה כמטרה להגנה עצבית משלבת מתילן כחול עם PBM משום שהם מתכנסים לתהליך הנשימה מכיוונים שונים: הצבע פועל כזרז במחזורי חמצון־חיזור התומכים בזרימת אלקטרונים, ואילו לפי ההשערה, PBM מעודדת ניתוק של חנקן חד־חמצני מעכב מציטוכרום c אוקסידאז בקומפלקס IV. יש להמשיך להציג את המנגנון האנזימטי הזה כהשערה.

שני מחקרי השילוב בעכברים המצוטטים ביותר משתמשים שניהם באור באורך גל של 810 nm, וזו בדיוק הסיבה שהם אינם מדגימים הפעלה של הצבע באור. במחקר על טיפול מקדים לפני חסך שינה, עכברים קיבלו מתילן כחול מדי יום במינון של 0.5 mg לקילוגרם, לייזר בפעימות באורך גל של 810 nm אחת ליומיים, או את שניהם, לפני החסך. הטיפול המקדים המשולב הגן על התנהגויות הקשורות לזיכרון ועל חלבונים סינפטיים בהיפוקמפוס, בעוד שהטיפולים הנפרדים נכשלו ברובם. במחקר על דחק כרוני עם טיפול במקביל, עכברים קיבלו PBM באורך גל של 810 nm ובפלואנס של 8 J לסנטימטר רבוע לצד מתן יומי של צבע במינון של 0.5 mg לקילוגרם. הלייזר הופעל תחילה והצבע הוזרק כעבור שעתיים, במטרה מפורשת להימנע מהקרנת רקמה המכילה צבע. כל שלוש זרועות המחקר הפכו את הליקויים בלמידה, עם תועלת מצטברת בעיקר ביחס לקורטיזול בסרום ולצורוני חמצן תגובתיים במוח. תוצאות אלה בוחנות שתי התערבויות מיטוכונדריאליות הניתנות יחד, הבחנה שאוסף המחקרים הפוטודינמיים משמר באמצעות תיעוד אורך הגל לכל התוויה.

הראיות הנוגעות לעור נמצאות בצד השני. נתונים מבני אדם על מתילן כחול בשילוב אור לעור מתרכזים בטווח של 630 עד 680 nm, עם צבע הניתן במריחה מקומית או בהזרקה לתוך הנגע, ובכוונה לגרום להרס או לעיצוב מחדש של הרקמה. זהו PDT בהגדרה. הצגת היעלמות הנגעים הזאת כהוכחה לכך שהצבע משפר PBM, או הצגת שיפור בעכברים בעקבות חשיפה ל־810 nm כהוכחה לכך שפאנל של 660 nm בשילוב צבע הוא פרוטוקול לתפקוד קוגניטיבי, מערבבת בין אופני הפעולה. מדריך המינון והפרמקולוגיה ומדריך הבטיחות והאינטראקציות מרחיבים על ההיבטים של ריכוז והתוויות נגד בסוגיה זו.

הגדירו את המושג לפני השוואת המספרים. אורך הגל קובע אם הצבע בולע אור. צפיפות הספק הקרינה ומשך החשיפה קובעים מה הכימיה עושה עם הבליעה הזאת. הגאומטריה קובעת איזה חלק מהדגימה חווה משהו מכל אלה. שתי חשיפות התואמות בפרמטר אחד ושונות בשאר הן ניסויים שונים, וההתייחסות אליהן כניתנות להחלפה זו בזו היא הטעות שמדריך זה נועד למנוע. שום פרוטוקול ביתי אינו נובע מכל אלה; אור באורך גל התואם לבליעת הצבע, בשילוב צבע הניתן באופן מערכתי, הופך חשיפה שאחרת הייתה מווסתת לפוטוכימיה המונעת באמצעות חומר מרגש־אור, שמקומה בידי אנשי מקצוע קליניים.