צביעת תאי לחי במתילן כחול: מה כדאי לראות

תלמידה מניחה טיפה של תרחיף תאי לחי על זכוכית נושא, מביטה במיקרוסקופ ורואה כמעט כלום. כמה צלליות חיוורות חולפות על פני שדה בהיר. היא משפרת את המיקוד, ואז מוסיפה אור, ולבסוף מסיקה שזכוכית הנושא ריקה. זכוכית הנושא אינה ריקה. התאים נמצאים שם. הם כמעט שקופים, והשקיפות היא בדיוק הבעיה שהצביעה הזאת נועדה לפתור.

כדאי להצביע על הפער הזה בין הציפייה לתמונה עוד לפני שמתחילים בפרוטוקול. מתחילים מצפים שמיקרוסקופ יחשוף פרטים כפי שזום במצלמה חושף שלט מרוחק. מיקרוסקופ שדה בהיר עושה דבר מצומצם יותר: הוא מציג הבדלים בבליעת אור. תא לחי שלא נצבע כמעט אינו בולע אור, ולכן כמעט אינו יוצר הבדל. מתילן כחול מוסיף את ההבדל. הוא נקשר בתוך התא, באופן לא אחיד, והופך את המבנה לניגודיות. ברגע שהתלמידים מבינים את העיקרון הזה, כל שלב בהמשך נתפס כתוצאה הגיונית ולא כמתכון.

רקע על האופן שבו צביעות פשוטות מוסיפות ניגודיות במעבדת בית הספר מועיל כאן, ורענון בנושא הכנת מיקרוסקופ שדה בהיר לפני הצביעה מונע מחצית מההכנות הכושלות. הכימיה שמאחורי הצבע נידונה במבוא למתילן כחול במיקרוסקופיה, המסביר מדוע דווקא הצבען הזה חוזר ומופיע על שולחן המעבדה.

הפרוטוקול הכיתתי

ההכנה הרטובה שלהלן היא ברירת המחדל הפשוטה יותר לשיעורים כלליים. אין צורך בלהבה או בשלב קיבוע. גרסת המשטח המקובע, המשמשת בכמה מדריכי מעבדה במכללות, מוסיפה ייבוש באוויר וקיבוע קצר בחום, כפי שמתואר בפעילות משטח תאי הלחי של North Central Texas College שפורסמה ב־Biology LibreTexts, אך קיבוע בחום הוא נוהג במיקרוביולוגיה, לא דרישה לצפייה בתאי אפיתל.

מה צריך: זכוכיות נושא וזכוכיות כיסוי נקיות, מטושים סטריליים חד־פעמיים (עדיפים) או קיסמים שטוחים חדשים, בקבוק טפטפת עם תמיסה מימית של מתילן כחול בריכוז 0.5 עד 1 אחוז, מים מזוקקים או מים נטולי יונים, נייר סופג, כפפות ומיקרוסקופ מורכב בעל הגדלות כוללות של 100x ו־400x.

1. שטפו את הפה במים בלבד. כך מסירים חלקיקי מזון שבהמשך נצבעים בעוצמה ומסיחים את הדעת מהתאים.
2. כל תלמיד דוגם רק את הלחי של עצמו. שפשפו בעדינות את פנים הלחי במטוש סטרילי חדש. הפעילו לחץ, אל תגרדו. הפסיקו הרבה לפני שמופיעים אי־נוחות או דימום.
3. גלגלו את המטוש על פני מרכז זכוכית נושא נקייה כדי ליצור שכבה דקה. שכבה דקה היא הגורם החשוב ביותר לקבלת הכנה שאפשר לפענח. משקע לבן עבה ייצבע ויהפוך לגוש כחול שלא ניתן לפענח.
4. הוסיפו טיפה אחת של מתילן כחול מעל המשטח. השאירו למשך 1 עד 3 דקות. דקה אחת מספיקה בפרוטוקולים רבים של מכללות; מדריך מעבדת המדעים לכיתה IX של NCERT משתמש בכ־3 דקות להכנה זמנית. זמן ארוך יותר אינו טוב יותר, וצביעת יתר היא שגיאת התזמון הנפוצה ביותר.
5. שטפו בעדינות במים מזוקקים או ספגו את עודף הצבען בנייר סופג, בהתאם לפרוטוקול המקומי. הרקע אמור להפוך לכחול בהיר, לא לכחול כהה עמוק.
6. הנמיכו זכוכית כיסוי בזווית כך שקצה אחד ייגע תחילה, ואז הניחו לה לרדת באיטיות. כך נמנעת לכידת בועות אוויר.
7. התחילו בהגדלה נמוכה כדי למצוא את התאים, ודאו מיקוד ומרכוז, ואז עברו ל־100x ולבסוף ל־400x. בהגדלה 400x השתמשו רק בכוונון המיקוד העדין.

ריכוז הצבען ראוי למשפט אחד של דיוק. פרוטוקולים בבתי ספר נוטים להשתמש בתמיסה מימית של מתילן כחול בריכוז של כ־1 אחוז. תמיסת מלאי חזקה יותר או חשיפה ממושכת מכהות את הרקע מהר יותר מכפי שהן מכהות את הגרעין, וכך הופכות את הניגודיות שעליה מבוסס התרגיל.

טיפול בטוח בחומר מהלחי

דגימות לחי מכילות רוק ומיקרואורגניזמים המצויים בדרך כלל בפה, ולכן יש להתייחס לכל משטח טרי כאל חומר שעלול להיות זיהומי, גם כאשר הדוגמים הם חברים בריאים לכיתה. הנחיות הבטיחות הביולוגית של האגודה האמריקאית למיקרוביולוגיה למעבדות הוראה מפרטות את העקרונות הכלליים: להעריך את הסיכון לפני המפגש, ללבוש כפפות, להגן על העיניים כאשר ייתכנו התזות, לשטוף ידיים לאחר מכן, לחטא את שולחנות המעבדה ולפנות ציוד חד־פעמי מזוהם במסלול המאושר לפסולת ביולוגית.

ארבעה כללים כיתתיים נותנים מענה לרוב הסיכון. דוגם אחד לכל מטוש ולכל זכוכית נושא, ללא שיתוף. דגימה עצמית בלבד, לעולם לא דגימה מחבר לכיתה. מטושים וקיסמים חד־פעמיים מועברים ישירות למכל הפסולת המיועד, ולא בחזרה לשולחן המעבדה. המתילן הכחול עצמו מכתים עור ובגדים ומגרה את העיניים, ולכן יש להשתמש בכפפות ולשמור על כללי ההיגיינה הרגילים לעבודה עם צבעים. אין להרחיב את התרגיל לגידול בתרבית של חומר כלשהו מהמשטח, ואין לאלתר קיבוע בחום של חומר אנושי טרי מחוץ לנוהל הבטיחות של בית הספר.

מה לראות, ומדוע זה נראה כך

בהגדלה 100x, חפשו תאים רחבים ושטוחים, בצבע כחול בהיר, בעלי מתאר סגלגל או מצולע לא סדיר. הם מופיעים כיחידים או כיריעות חופפות באופן רופף. בכל תא יש בדרך כלל כתם אחד בצבע כחול כהה יותר. הכתם הזה הוא הגרעין. שימו לב גם לסידור: תאי אפיתל קשקשיים הם אריחים דקים, לא כדורים, ולכן קצותיהם נראים כמו זיגוג סדוק ולא כמו בלונים עגולים.

בהגדלה 400x, ניתן להבחין בבירור בשלושה מאפיינים. גבול התא נראה כקו דק וכהה יותר המקיף את התא. הציטופלזמה ממלאת את פנים התא בכחול בהיר ואחיד. הגרעין כהה יותר וקומפקטי יותר, לעיתים קרובות סגלגל, ובדרך כלל נמצא סמוך למרכז, אך לא תמיד. בקשו מהתלמידים לתעד את שלושתם, וגם את הצורה וההגדלה, משום שדף העבודה מבקש בדיוק את אלה.

יש כאן נקודה חשובה של דיוק, שדפי עבודה רבים טועים בה. הגבול הנראה מתאים לאזור קרום התא, אך הקרום עצמו, דו־שכבה ליפידית שעובייה בערך 7 עד 10 ננומטרים, נמצא הרבה מתחת לכושר ההפרדה של מיקרוסקופ בית ספרי. מה שהתלמידים רואים הוא השפה האופטית של התא, יחד עם צבען שהצטבר שם. אותה הסתייגות חלה גם על אברונים. מיטוכונדריה, רשתית אנדופלזמית, גופיפי גולג'י וריבוזומים אינם נראים בהכנה הזאת. מיקרוסקופ אור רגיל מסוגל להפריד פרטים עד לגודל של כ־0.2 מיקרומטרים בתנאים טובים, כפי שמוסבר ברקע בביולוגיה של התא על כלי מיקרוסקופיה באתר NCBI, ורוב המבנים האולטרה־מיקרוסקופיים נמצאים מתחת לגבול הזה או סמוך אליו. הגדלה ריקה גבוהה יותר מגדילה את התמונה בלי להוסיף פרטים.

מדוע הגרעין נצבע בגוון הכהה ביותר? מתילן כחול הוא צבען קטיוני, בעל מטען חיובי בתמיסה, והוא נקשר לחומרים בעלי מטען שלילי בתא, בראש ובראשונה לחומצות גרעין. הכרומטין מרכז DNA בגרעין, ולכן הגרעין אוסף את כמות הצבען הגדולה ביותר. הציטופלזמה מכילה RNA ומולקולות טעונות אחרות, ולכן גם היא נצבעת, אך באופן מפוזר יותר ובגוון בהיר יותר. ההסתייגות המרכזית: מתילן כחול אינו צבען ייחודי ל־DNA. מחקר על פיזור מתילן כחול בהדמיית גרעיני תאים מתאר את הקטיון כנקשר לאזורים עשירים בחומצות גרעין, ומחקר כמותי מוקדם יותר על קשירת מתילן כחול בהכנות תאים מצא שרוב הצבען הקשור היה קשור לחומצות גרעין. לכן גרעין כהה לצד ציטופלזמה בהירה הוא דפוס של ניגודיות, לא בדיקה מולקולרית.

טעויות שתלמידים יעשו, וכיצד לפרש אותן

כמעט כל הכנה כושלת מתאימה לאחד מחמישה דפוסים. למדו את התלמידים לזהות את הבעיה בהכנה במקום לחזור עליה באופן עיוור.

צביעת יתר הופכת את התאים ואת הרקע לכהים באופן אחיד, כך שהגרעין נבלע בשדה הראייה. תקנו זאת באמצעות זמן צביעה קצר יותר או שטיפה יסודית יותר. צביעה חסרה משאירה צלליות שנעלמות כשמגבירים את האור; האריכו את הזמן במרווחים של שלושים שניות. משטחים עבים יוצרים גושים צפופים וחופפים, שבהם אי אפשר לעקוב אחר שום מתאר; התיקון הוא מכני — בפעם הבאה יש לפרוס שכבה דקה יותר, משום ששום שטיפה לא תציל ערמת תאים. בועות אוויר נראות כעיגולים מושלמים בעלי שוליים כהים וחדים, ומסיחות את דעתם של מתחילים שטועים לחשוב שהן מבנים; הניחו מחדש את זכוכית הכיסוי באיטיות ובזווית. נקודות כהות זעירות המפוזרות על התאים או סביבם הן בדרך כלל חיידקים המצויים באופן רגיל בפה, כפי שמציינים פרוטוקולים בית ספריים כגון ההליך לתאי לחי של Ingrid Science. הן מאשרות שהפה מאוכלס, דבר שהתלמידים עשויים לזכור היטב, אך אי אפשר לזהות בתרגיל הזה לאיזה מין הן שייכות, ואין לצייר אותן כחלקי התא. שאריות מזון וגדילי ריר נצבעים באופן לא סדיר ובעוצמה; השטיפה המקדימה נועדה לצמצם אותם.

מה התרגיל הזה אינו יכול לעשות

זוהי תצפית לימודית, לא בדיקה אבחונית. שום דבר במראה התאים בצביעה כיתתית אינו יכול לאבחן זיהום, סרטן או מחלה כלשהי, ואין לקרוא את המאמר כאילו הוא מרמז אחרת. ההכנה מציגה צורה, גבול, ציטופלזמה וגרעין בשתי הגדלות. היא אינה מציגה את המבנה האולטרה־מיקרוסקופי של הקרום, פרטי אברונים או זהות מולקולרית. ציון מפורש של המגבלה מגן הן על המדע והן על התלמידים: תוצאה טובה היא ציור עם סימונים נכונים ותיעוד של ההגדלה והצבען, לא מסקנה לגבי מצב בריאותי.

דף עבודה לתלמידים ותמונות מיקרוסקופ עם סימונים

שני חומרי העזר של הפרויקט בעמוד הזה הם תמונת המיקרוסקופ עם הסימונים שלמעלה ודף העבודה שלהלן. הדפיסו עותק אחד של דף העבודה לכל תלמיד, או הקרינו אותו ובקשו מהתלמידים להעתיק את התיבות למחברות.

כיצד להשתמש בו במפגש של 45 דקות: עשר דקות לתדריך בטיחות ולדגימה, עשר דקות לצביעה ולהכנת התכשיר, חמש עשרה דקות לתצפית ולשרטוט בשתי ההגדלות, ועשר דקות לרשימת הבדיקה ולהשוואה לתמונת המיקרוסקופ עם הסימונים. סעיפי רשימת הבדיקה הם טכניים במכוון. משטח דק, זמן צביעה נכון, גרעין כהה יותר מהציטופלזמה, הגדלה מתועדת. תלמיד שיכול לסמן את כל הארבעה הבין את העיקרון שהשיעור נועד ללמד: מיקרוסקופים מציגים הבדלים, וצביעות יוצרות את ההבדלים שכדאי להציג.