צביעה פשוטה במתילן כחול לעומת צביעת גראם: מה כל שיטה יכולה להוכיח

סטודנט מכין משטח מתרבית המסומנת E. coli, מכסה אותו במתילן כחול למשך דקה אחת, שוטף ובוחן דרך עדשת טבילה בשמן. מתגים כחולים ממלאים את שדה הראייה. בדוח המעבדה נכתב: ״מתגים גראם־שליליים זוהו כ־E. coli.״ התצפית נכונה. המסקנה אינה נתמכת בממצאים שעל הזכוכית הזאת.

הטעות היא מושגית, לא טכנית. הסטודנט התייחס לצביעה פשוטה כאילו הייתה בדיקה מבדלת. צביעה פשוטה וצביעת גראם עונות על שאלות שונות, משום שהן מבוססות על עקרונות צביעה שונים. האחת שואלת: איזו צורה קיימת. האחרת שואלת: כיצד דופן התא מתנהגת כאשר היא נחשפת לתנאי מבחן. כשמבלבלים בין השתיים, גם משטח שנצבע כראוי מוביל לדוח שאינו מבוסס.

השוואה זו מפרידה בין שתי השיטות, מראה אילו טענות כל תוצאה מאפשרת לטעון ועונה על שתי השאלות שסטודנטים שואלים יותר מכול: האם אפשר להשתמש במתילן כחול בצביעת גראם, ומה צביעה של E. coli במתילן כחול מראה בפועל.

התשובה הקצרה

צביעה פשוטה במתילן כחול צובעת כל תא שניתן לצביעה באותו כחול, ולכן היא חושפת מורפולוגיה (מתגים, כדורים, סלילים) וסידור (תאים בודדים, זוגות, שרשראות), אך אינה מלמדת דבר על סיווג גראם. צביעת גראם מוסיפה יוד, שלב הסרת צבע וצביעת ניגוד, ולכן היא מפרידה בין חיידקים גראם־חיוביים (סגולים) לגראם־שליליים (ורודים או אדומים), לפי האופן שבו מעטפותיהם משמרות את הצבע. מתגים כחולים לאחר צביעה במתילן כחול פירושם ״קיימים תאים בצורת מתג״. מתגים ורודים לאחר רצף מלא של צביעת גראם פירושם ״קיימים מתגים גראם־שליליים״. הטענה השנייה מבוססת יותר, משום שההליך כלל בדיקה נוספת.

למשפחת השיטות הרחבה יותר לצביעת חיידקים בצבע יחיד, שאליה משתייך מאמר זה, ראו אטלס הצביעה למיקרוסקופיה.

צביעה פשוטה: צבע אחד, שאלה אחת

מתילן כחול הוא צבע בסיסי (קטיוני). היון הצבעוני שלו נושא מטען חיובי ונקשר למבנים בעלי מטען שלילי בתא, ובהם חומצות גרעין וקבוצות חומציות על פני השטח, ולכן התאים נראים כחולים על רקע בהיר. OpenStax מתאר את עקרון הצביעה החיובית הזה בפרק העוסק בצביעה. קטיון הצבע עצמו הוא יון הפנותיאזין הקטן והשטוח המפורט במדריך הכימיה של מתילן כחול; יון הכלוריד הנגדי אינו אחראי לצביעה.

פרוטוקול הוראה מקובל הוא פשוט במכוון: מכינים משטח דק, מייבשים באוויר, מקבעים בחום, מכסים בתמיסה מימית של מתילן כחול בריכוז של כ־1% למשך כדקה אחת, שוטפים בעדינות במים, סופגים את הנוזל עד לייבוש ובוחנים בטבילה בשמן. פרוטוקול הוראה של LibreTexts מציג בדיוק את המתכונת הזאת של 1% למשך דקה אחת, ומציין שבמעבדות מסוימות מאריכים את הזמן. אין מקבע צבע, אין מסיר צבע ואין צבע שני. היעדרם הוא העיקר. כאשר משתמשים בצבע אחד בלבד ללא הסרה בררנית, כל תא שקושר צבע מקבל בסופו של דבר את אותו הצבע.

במקרה של E. coli, שדה הראייה הצפוי הוא מתגים כחולים (בצילים), בודדים, בזוגות או בקבוצות קטנות. הכחול נובע מהצבע. צורת המתג נובעת מהאורגניזם. אבל השילוב אינו מזהה את האורגניזם, משום שמינים רבים הם מתגים ומתגים רבים נצבעים בכחול בצביעה פשוטה. ATCC מבהיר במפורש את המגבלה הזאת — מורפולוגיה בלבד — במדריך התרביות המיקרוביולוגי שלו. בדוח נכון נכתב: ״נצפו בצילים כחולים.״ כל טענה מעבר לצורה ולסידור מחייבת ראיות נוספות.

צביעת גראם: ארבעה ריאגנטים, מבחן התנהגות אחד

צביעת גראם היא צביעה מבדלת. היא מעבירה את כל התאים באותו רצף ובוחנת אילו תאים משמרים את הצבע הראשון ואילו מאבדים אותו. הפרוטוקולים לצביעת גראם של האגודה האמריקאית למיקרוביולוגיה מגדירים את הסדר המקובל של ארבעת השלבים: קריסטל ויולט (צבע ראשוני), יוד גראם (מקבע צבע), אלכוהול או תערובת אצטון־אלכוהול (מסיר צבע), ולבסוף ספרנין (צבע ניגודי).

מודל ההוראה המקובל מסביר את ההפרדה באמצעות מבנה המעטפת. לתאים גראם־חיוביים יש דופן פפטידוגליקן עבה, שמאבדת מים ומשמרת את קומפלקס הקריסטל ויולט–יוד במהלך השטיפה באלכוהול. לתאים גראם־שליליים יש שכבת פפטידוגליקן דקה וכן ממברנה חיצונית עשירה בליפידים, שמסיר הצבע פוגע במבנה שלה; לכן הקומפלקס נשטף החוצה ולאחר מכן התאים קולטים ספרנין. הסקירה על צביעת גראם ב־NCBI Bookshelf מציגה את ההסבר הזה המבוסס על דופן התא. מומחים מוסיפים שהתמונה הפיזיקוכימית המלאה מורכבת יותר מעובי הדופן לבדו, אך לצורך פרשנות בעבודת המעבדה כלל ההתנהגות תקף: סגול פירושו שהצבע נשמר, ורוד פירושו שהצבע אבד ולאחר מכן בוצעה צביעת ניגוד.

לוחות איור. רישומים מסוגננים להשוואת שיטות, לא צילומים מיקרוסקופיים. הצבעים מוצגים בפשטות כדי ללמד את העיקרון: צבע אחד בצביעה פשוטה, שני צבעים לאחר הסרת הצבע בצביעת גראם.

האם אפשר להשתמש במתילן כחול בצביעת גראם

לשאלה הזאת יש שתי משמעויות, והן דורשות תשובות שונות.

המשמעות הראשונה: האם כיסוי יחיד במתילן כחול יכול להחליף את כל רצף צביעת גראם. לא. ללא יוד, מסיר צבע וצבע ניגודי אין שלב מבדיל, ולכן לא נבדק שום סיווג גראם. שדה כחול לאחר שימוש במתילן כחול בלבד הוא תוצאה של צביעה פשוטה, גם אם הבקבוק ניצב ליד הריאגנטים של צביעת גראם. אין לרשום אותו כתוצאת גראם.

המשמעות השנייה: האם מתילן כחול יכול להחליף ספרנין כצבע הניגודי בשלב 4. מבחינה תפקודית הוא יכול לצבוע את התאים שצבעם הוסר, ובתרגיל לימודי אפשר לצפות שלאחר החלפה כזאת יתקבלו תאים גראם־חיוביים סגולים ותאים גראם־שליליים כחולים. ההיגיון תקף, משום שתאים גראם־שליליים שעברו הסרת צבע כראוי הם כמעט חסרי צבע ויקלטו צבע קטיוני אחר. אבל זה אינו הפרוטוקול המקובל. פרוטוקולי ASM מציינים ספרנין, לצד חלופות מוכרות כגון פוקסין בסיסי בגרסאות מסוימות, ולא מתילן כחול. יש גם חיסרון מעשי: קשה יותר להבחין בין כחול לסגול מאשר בין ורוד לסגול, במיוחד למתחילים ובמיוחד כאשר מנורות המיקרוסקופ חלשות. במסגרת לימודים ובכל מקרה שבו יש חשיבות לתוצאה, השתמשו בצבע הניגודי המוגדר בפרוטוקול שלכם, בדרך כלל ספרנין, והתייחסו לצביעת ניגוד במתילן כחול כאל גרסה להדגמה ולא כאל חלופה תקנית שקולה.

השאלה הקשורה לכך, כיצד מתילן כחול משתווה לאפשרויות אחרות של צביעה בצבע יחיד, נידונה בהשוואה בין שיטות צביעה פשוטה של חיידקים.

מה צביעת E. coli במתילן כחול מוכיחה, ומה לא

E. coli הוא מתג גראם־שלילי, אך המשפט הזה משלב עובדות מכמה שיטות: מורפולוגיה ממיקרוסקופיה, תגובת גראם מצביעת גראם, וזהות מתרבית בצירוף בדיקות ביוכימיות או מולקולריות. משטח שנצבע במתילן כחול תורם רק את החלק הראשון. הוא מבסס את נוכחותם של תאים בצורת מתג בדגימה שנצבעה ואת אופן סידורם. הוא אינו מבסס את תגובת גראם, משום שלא בוצע מבחן הסרת צבע. הוא אינו מזהה את המין, משום שמתגים ממינים רבים נראים דומים ברמת ההפרדה הזאת.

כאן הדוחות משתבשים באופן צפוי. הכותב מכניס ידע מוקדם (״התרבית הזאת אמורה להיות E. coli, ו־E. coli הוא גראם־שלילי״) לשורת התצפית, כך שנראה שהמשטח מאשר דבר שלמעשה רק הונח מראש. דוח ברור יותר מפריד בין הרבדים: ״צביעה פשוטה במתילן כחול: נצפו בצילים כחולים; מורפולוגיה בלבד, לא נבדק סיווג גראם.״ לאחר מכן, אם צביעת גראם בוצעה כראוי עם בקרות: ״צביעת גראם: מתגים ורודים, ממצא התואם גראם־שליליות.״ זהות המין נקבעת בהמשך, בתהליך הזיהוי, ולא על סמך הצבע בלבד.

מדריך מעשי לפרשנות

השתמשו בכלל ההחלטה הזה בעבודת המעבדה. אם כל התאים בצבע אחד ובפרוטוקול נעשה שימוש בצבע אחד ללא מסיר צבע, ביצעתם צביעה פשוטה. דווחו על הצורה, על הערכת הגודל ועל הסידור. עצרו שם. אם הפרוטוקול כלל קריסטל ויולט, יוד, מסיר צבע וצבע ניגודי, לצד בקרות חיוביות ושליליות ידועות, ביצעתם צביעת גראם. דווחו על הצבע ועל המורפולוגיה: קוקיים סגולים בשרשראות, מתגים ורודים וכן הלאה.

שלוש טעויות אחראיות לרוב הבלבול. הראשונה היא פרשנות יתר של מתגים כחולים כאישור לזיהוי E. coli. השנייה היא רישום של משטח מתילן כחול תחת הכותרת ״צביעת גראם״ במחברת, דבר שיטעה קוראים בהמשך. השלישית היא החלפה לא מבוקרת של צבעים ניגודיים ולאחר מכן השוואת צבעים בין מעבדות כאילו נעשה שימוש באותה מערכת צבעים. לכל טעות יש אותו תיקון: ציינו את השיטה שבוצעה בפועל וטענו רק את מה שהשיטה הזאת בודקת.

הצביעה הפשוטה ראויה למקומה דווקא משום שהיא מאפשרת לטעון מעט. היא מהירה, סלחנית ומספקת כאשר השאלה היא מורפולוגית: האם יש שם משהו, ומה צורתו. כשהשאלה היא סיווג, בצעו את הבדיקה המבדלת. המשטח הכחול מראה כיצד התאים נראים. המשטח הסגול או הוורוד מראה כיצד הדפנות שלהם מתנהגות. אף אחד מהמשטחים, בפני עצמו, אינו מגלה מהו המין.