מתילן כחול, Nrf2 וביוגנזה מיטוכונדריאלית: מה נמדד ומה עדיין בגדר השערה

משפט אחד מופיע לעיתים קרובות בכתיבה על מתילן כחול: הוא מפעיל את Nrf2 ובונה מיטוכונדריות חדשות. המשפט נשמע כמו טענה אחת, אך הוא כולל שני מושגים שונים, שנחקרו במערכות שונות ועל סמך סוגים שונים של ראיות. הראשון הוא מסלול איתות, חיישן שמפעיל גנים של הגנה. השני הוא תוכנית בנייה, שבה התא מייצר עוד מנגנונים מיטוכונדריאליים. אות יכול לעורר בנייה, אבל הוכחה שהאות הופעל אינה זהה להוכחה שהמבנה הוקם, והוכחה שיש יותר חומרי בנייה אינה זהה להוכחה שאספקת האנרגיה טובה יותר. המאמר הזה מפריד בין שלושת הדברים.

המושג Nrf2: חיישן, לא מגן

Nrf2 (גורם גרעיני הקשור לגורם אריתרואידי 2, מספר 2) הוא גורם שעתוק, חלבון שתפקידו להפעיל גנים. בתנאי מנוחה הוא מוחזק בציטופלזמה בידי חלבון חיישן בשם Keap1, שמוסר אותו למנגנון הפינוי של התא לצורך פירוק מתמשך. כאשר מחמצנים או אלקטרופילים משנים שיירי ציסטאין תגובתיים ב-Keap1, הפינוי נעצר. Nrf2 שנוצר זה עתה מצטבר, עובר לגרעין, יוצר זוגות עם חלבוני Maf קטנים ונקשר לרצפי DNA הנקראים אלמנטים של תגובה נוגדת חמצון. הקישור הזה מפעיל מערך של גנים של הגנה.

המדדים המקובלים של המסלול הזה מוגדרים היטב. NQO1 (דהידרוגנאז קינון NAD(P)H מספר 1) ו-TrxR1 (תיורדוקסין רדוקטאז 1) הם בין גני המטרה האמינים ביותר של Nrf2. הביטוי של HO-1 (הם אוקסיגנאז-1) ניתן להשראה חזקה, אך הוא מגיב גם לווסתים אחרים. אנזימים כגון SOD וקטלאז הם חלק ממנגנוני נוגדי החמצון, אך רמותיהם נשלטות בידי גורמי שעתוק רבים, ולכן עלייה ב-SOD אינה מוכיחה כשלעצמה ש-Nrf2 היה הגורם. הראיות הקרובות ביותר לאירוע האיתות הן הצטברות Nrf2 בגרעין, הפעלת מערכת מדווחת של ARE, או השראת ביטוי של גני מטרה קנוניים שנעלמת כאשר Nrf2 מוסר. כל השאר — רמות נמוכות יותר של מחמצנים, הישרדות טובה יותר בתנאי עקה, רמות גבוהות יותר של גלוטתיון — הם תוצאות בהמשך המסלול, שמסלולים רבים יכולים לייצר.

הממצא המוקדם ביותר על מתילן כחול בסיפור הזה נמצא קרוב לקצה הישיר יותר של הסולם. פיברובלסטים שנחשפו למתילן כחול בריכוז ננומולרי הראו עיכוב בהזדקנות התאית, לצד תכולה גבוהה יותר של קומפלקס IV, צריכת חמצן גבוהה יותר והשראת ביטוי של אנזימי שלב-2, TrxR1 ו-NQO1, כפי שדווח במחקר שקישר לראשונה בין מתילן כחול לשיפור מיטוכונדריאלי ולעיכוב ההזדקנות התאית. TrxR1 ו-NQO1 הם בדיוק גני המטרה הקנוניים של Nrf2 שקורא זהיר רוצה לראות. מה שהמחקר לא הראה הוא אירוע האיתות עצמו: לא נמדד Nrf2 בגרעין, לא נעשה שימוש במערכת מדווחת של ARE, ולא נכללה ביקורת שבה הגן Nrf2 הושבת. לכן הפרשנות המדויקת היא שמתילן כחול משרה ביטוי של גני מטרה ידועים של Nrf2 במערכת הזאת, ממצא שמתיישב עם הפעלת Nrf2 אך אינו מבודד אותו כגורם. השראת הביטוי של גן מטרה נמצאת צעד אחד בהמשך המסלול אחרי המתג.

מושג הביוגנזה: תוכנית עם שלוש נקודות בדיקה

ביוגנזה מיטוכונדריאלית היא התוכנית שבאמצעותה התא מגדיל את היכולת המיטוכונדריאלית שלו. ההיררכיה המתוארת בספרי הלימוד עוברת דרך שלוש נקודות בדיקה. ראשית, הקו-אקטיבטור PGC-1alpha מפעיל את התוכנית. שנית, גורמי שעתוק גרעיניים — באופן מבלבל, אחד מהם נקרא NRF1, גורם נשימתי גרעיני 1, והוא חלבון שונה מ-Nrf2 — מניעים את ביטוים של גנים מיטוכונדריאליים, ובהם TFAM, שמתחזק ומשכפל DNA מיטוכונדריאלי. שלישית, בסופו של דבר יש בתא יותר גנומים מיטוכונדריאליים ויותר מרכיבים של מנגנון הנשימה, שאפשר למדוד באמצעות מספר עותקי mtDNA, פעילות ציטראט סינתאז, או השפע והפעילות של קומפלקסי הנשימה.

כל נקודת בדיקה תומכת בטענה בעוצמה שונה מזו של קודמתה. רמות גבוהות יותר של RNA שליח של PGC-1alpha או TFAM מראות שניתנה הוראה להפעיל את התוכנית, לא שהיא הושלמה. יותר mtDNA או יותר חלבון של קומפלקס IV מעידים על יותר חומר, אך גם מיטוכונדריות שעברו ארגון מחדש יכולות להיראות כך. נשימה משופרת, צריכת חמצן גבוהה יותר או פעילות מוגברת של קומפלקסים מעידות על שינוי בתפקוד, אך התפקוד יכול להשתפר בלי שנוצרו כלל מיטוכונדריות חדשות. טענה מבוססת לביוגנזה משלבת את שלושתם: ויסות, תכולה ותפקוד.

מחקר ההמשך בפיברובלסטים בחן את רוב השרשרת הזאת. בתאי IMR90 אנושיים שטופלו במתילן כחול בריכוז 100 ננומולר, היחס בין NAD ל-NADH עלה זמנית בתוך 15 דקות וחזר לרמת הבסיס בתוך יום. אחרי אות האנרגיה הזמני הזה הופיע זרחון זמני של חיישן האנרגיה AMPK, ולאחריו השראת ביטוי של PGC-1alpha ושל SURF1, חלבון הנחוץ להרכבת קומפלקס IV מתפקד. הפעילות של קומפלקס IV הוכפלה בקירוב, רמות המחמצנים בתאים ירדו בכ-28 אחוז, והטלומרים נשחקו לאט יותר. הרצף המלא מתואר במאמר המקשר בין פעילות החמצון-חיזור של מתילן כחול לבין AMPK וביוגנזה מיטוכונדריאלית.

שני פרטים במאמר הזה ראויים לתשומת לב, משום שהם מסוג הפרטים שבדרך כלל נשמטים. ראשית, דפוס ההפעלה היה חשוב יותר מעצם קיומה: מתילן כחול הפעיל את AMPK באופן זמני, בעוד תרופת ההשוואה AICAR הפעילה אותו באופן מתמשך, והמפעיל הזמני עיכב הזדקנות תאית ביעילות גבוהה בערך פי שמונה. לכן טענה בנוסח "מתילן כחול מפעיל את AMPK" אינה שלמה; הטענה הרלוונטית היא שהוא מפעיל את AMPK באופן זמני, וההשוואה מרמזת שהפעלה מתמשכת אינה פועלת באותו אופן. שנית, מתילן כחול לא שינה את מחזור התא, מה ששולל את ההסבר החלופי הפשוט ביותר: שהתאים פשוט התחלקו לאט יותר ולכן נראו צעירים יותר.

הענף בעכברים: התנהגות, גנומים וגורם מפעיל פרדוקסלי במכוון

העבודה בתרביות תאים הורחבה לבעלי חיים בידי קבוצה שחקרה עכברים בגיל הביניים. לאחר 60 ימים של מתילן כחול במתן פומי, העכברים שטופלו שמרו יותר על הסבולת הגופנית ועל התנהגות החקר שלהם, והראו פחות התנהגות דמוית חרדה מעכברים מזדקנים שלא טופלו. ברקמת המוח, ביטוים של גנים שההזדקנות דיכאה — NRF1, TFAM, SOD2 ותת-היחידה COX1 של קומפלקס IV — חזר לכיוון הרמות של עכברים בוגרים, ומספר עותקי mtDNA עלה. התוצאות האלה, המשלבות התנהגות, ויסות ושפע גנומים, מדווחות במחקר בעכברים בגיל הביניים על מתילן כחול וביוגנזה מיטוכונדריאלית במוח.

הגורם המפעיל המוצע הוא החלק המעניין, משום שהוא מנוגד לסיפור הפשוט שלפיו מתילן כחול הוא נוגד חמצון. בעכברים שטופלו נצפתה יצירה מוגברת של מיני חמצן תגובתיים במיטוכונדריות במוח, ובפרט מי חמצן. השערת המחברים: אות מתון של מי חמצן הוא שמפעיל את מסלול Nrf2, שמניע בתורו את תוכנית הביוגנזה. במודל הזה מתילן כחול הוא מעודד חמצון בשלב ההפעלה ונוגד חמצון בשלב התוצאה — דפוס שפרמקולוגים מכנים הורמזיס, שבו עקה קטנה מעוררת תגובת הגנה גדולה יותר מהעקה עצמה. השאלה אם העלייה במי החמצן אכן גורמת להפעלת Nrf2 לא נבדקה ישירות; זהו הגשר המשוער, לא קשר שנמדד.

מחקר נלווה של אותה קבוצה בחן בתנאי עקה את היבט הבטיחות של ההשערה הזאת. במיטוכונדריות מבודדות מהמוח, מתילן כחול הגביר את ייצור מי החמצן כבר בריכוזים של 50 ננומולר, ובכל זאת ריכוזים טיפוליים לא גרמו לנזק שניתן לזהות ב-DNA המיטוכונדריאלי. רק בריכוז של 100 מיקרומולר, הרבה מעל הרמות הטיפוליות, נמצא נזק במקטעי mtDNA מסוימים, והשילוב של הצבע בריכוז 20 מיקרומולר עם אור אדום יצר חמצן סינגלטי שפגע ב-mtDNA באופן נרחב. זו ההתנהגות המוכרת של הצבע כחומר מגביר רגישות לאור, ולא פעילותו הפרמקולוגית בחושך. טיפול מקדים אף הגן על מיטוכונדריות בחלק הגחוני של המוח התיכון מפני פגיעות ב-mtDNA שנגרמו מרוטנון. תגובת המינון ובדיקות הביקורת לגנוטוקסיות מפורטות במחקר על ייצור מי חמצן לא גנוטוקסי באמצעות מתילן כחול.

מה נמדד ומה משוער: קריאת התרשים

תרשים המסלול שלהלן נוצר עבור המאמר הזה כדי לחדד את ההבחנה שנעשתה לאורך הטקסט. תיבות עם גבולות רציפים מציינות שלבים בעלי תמיכה ניסויית ישירה בספרות על מתילן כחול: מחזורי חמצון-חיזור שמשנים את יחס NAD/NADH, זרחון זמני של AMPK, השראת ביטוי של PGC-1alpha ו-SURF1, פעילות מוגברת של קומפלקס IV, השראת ביטוי של NQO1 ו-TrxR1, שיקום ביטוי גני ביוגנזה ומספר עותקי mtDNA במוח העכבר, ועלייה במי חמצן ללא נזק ל-mtDNA במינונים טיפוליים. תיבות עם גבולות מקווקווים מציינות את הקשרים המשוערים: זיהוי אות מי החמצן בידי Keap1, הצטברות Nrf2 בגרעין שמניעה את ביטוי גני ההגנה, והחץ הסיבתי מהפעלת Nrf2 אל תוכנית הביוגנזה. השלבים המקווקווים האלה סבירים, מתיישבים עם הנתונים ותואמים את הביולוגיה המקובלת בספרי הלימוד, אך במאמרים האלה הם לא נמדדו עם בדיקות הביקורת — Nrf2 בגרעין, מערכות מדווחות של ARE, השבתת הגן Nrf2 — שהיו מאפשרות להפוך אותם לתיבות בעלות גבולות רציפים.

שלושה מקורות לבלבול מתבהרים כשהתרשים נמצא מולכם. ראשית, NRF1 ו-Nrf2 הם חלבונים שונים עם שמות כמעט זהים; המחקר בעכברים מדד גורם נשימתי גרעיני 1, מווסת ביוגנזה, ולא את גורם השעתוק נוגד החמצון, וערבוב ביניהם מצמצם את התרשים כולו לצומת יחיד. שנית, ביטוי גנים הוא תחילת הסיפור, לא סופו; שיקום רמות ה-RNA השליח של TFAM או COX1 תומך בכך שניתנה הוראה לביוגנזה, בעוד מספר עותקי mtDNA ופעילות קומפלקס IV הם הראיות לכך שההוראה התממשה. שלישית, התוצאה נוגדת החמצון אינה מוכיחה שהדבר התרחש דרך Nrf2; הירידה של 28 אחוז במחמצנים בפיברובלסטים וההגנה מפני רוטנון בעכברים הן תוצאות אמיתיות בהמשך המסלול, אך כמה מסלולים מתכנסים אליהן.

מה יהפוך תיבה מקווקוות לתיבה בעלת גבול רציף

הניסויים החסרים הם ניסויים מקובלים. מדידת חלבון Nrf2 בגרעין לאחר חשיפה למתילן כחול, לאורך זמן ובתזמון התואם לאות הזמני של AMPK, תבדוק אם שתי הזרועות אכן מופעלות יחד, כפי שטוענת השערת ההפעלה המסונכרנת. מערכת מדווחת המונעת בידי ARE תאשר פעילות שעתוק, במקום להסיק אותה מגני המטרה. חזרה על מדדי הביוגנזה לאחר הפחתת ביטוי Nrf2 או השבתת הגן שלו תבדוק את החץ הסיבתי ישירות: אם השראת קומפלקס IV והעלייה במספר עותקי mtDNA נמשכות ללא Nrf2, הגשר שגוי וזרוע AMPK לבדה אחראית להשפעה. בבעלי חיים, מחקר במתן מתמשך עם אותן שלוש נקודות בדיקה — ויסות, תכולה ותפקוד — יבדוק אם התוכנית נשארת פעילה או מסתגלת. עד אז, ההפעלה המסונכרנת של מסלולי האנרגיה וההגנה נשארת מה שהמחברים כינו אותה: גורם מפתח אפשרי, לא מנגנון מבוסס.

קוראים שמגיעים מתחום הפרמקולוגיה הרחב יותר עשויים לרצות גם את ההקשר שסביב הנושא: כיצד מתילן כחול מעביר אלקטרונים ברמה המיטוכונדריאלית, אילו השפעות נוספות יש לו על מיטוכונדריות ועל האנרגיה בתא, היכן משתלבים ממצאי ההזדקנות התאית במחקר ההזדקנות, כיצד טענות לביוגנזה קשורות לביצועים קוגניטיביים, ונתוני הבטיחות שמציבים גבולות לכל דיון במינון. כל אחד מאלה הוא מושג נפרד עם ראיות משלו, וכל אחד ראוי לאותה הבחנה בין מה שנמדד למה שמשוער, כפי שנעשתה במאמר הזה לגבי Nrf2.