מתילן כחול ותחמוצת החנקן: NOS, cGMP ואיתות בכלי הדם

השאלה נשמעת פשוטה: האם מתילן כחול מעכב את תחמוצת החנקן? במעבדה, התשובה מתפצלת לארבע שאלות נפרדות, ולכל אחת בדיקה ניסויית שונה. הבלבול ביניהן הוא הסיבה העיקרית לכך שכתיבה על מתילן כחול ותחמוצת החנקן נשמעת נחרצת אך מעורפלת.

אפשר לחשוב על אות תחמוצת החנקן כעל שרשרת בעלת ארבע חוליות. גן משועתק כדי לייצר סינתאז של תחמוצת החנקן. האנזים ממיר ארגינין לתחמוצת החנקן. הגז מתפזר אל מטרתו לפני שהוא מגיב עם חומר אחר. גואנילאט ציקלאז מסיס מזהה אותו ומייצר GMP מחזורי. פורסמו השפעות של מתילן כחול בכל חוליה, אך הראיות מגיעות ממערכות ניסוי שונות, מריכוזים שונים ומאיזופורמים שונים. תוצאה בחוליה אחת אינה מוכיחה פעולה בחוליה אחרת.

השרשרת המקובלת, במילים פשוטות

בדופן כלי דם, הרצף המקובל מתנהל כך. גירוי פועל על תא אנדותל. סינתאז אנדותליאלי של תחמוצת החנקן, המכונה eNOS או NOS3, מייצר פעימה קטנה של תחמוצת החנקן. הגז מתפזר אל תא השריר החלק הסמוך, נקשר לקבוצת ההם בעלת הברזל המחוזר של גואנילאט ציקלאז מסיס, ומאיץ את ההמרה של GTP ל־GMP מחזורי. GMP מחזורי מפעיל את חלבון קינאז G, הטיפול התאי בסידן משתנה, והשריר מתרפה.

יש שרשרת שנייה שכדאי להבחין בינה לבין הראשונה. במהלך זיהום או חשיפה לציטוקינים, תאים משעתקים אנזים אחר: סינתאז מושרה של תחמוצת החנקן, או iNOS, המכונה גם NOS2. הוא מייצר שטפים גדולים וממושכים יותר של תחמוצת החנקן לעומת eNOS. איזופורם שלישי, NOS עצבי או nNOS, שייך להקשר נוסף. כשמאמר מציין סינתאז של תחמוצת החנקן בלי לציין את האיזופורם, עצרו ובדקו איזה מהם נמדד. הסקירה על האופן שבו מתילן כחול מעביר אלקטרונים מדגישה את אותה נקודה לגבי מטרות חמצון־חיזור באופן כללי: מנגנון ההעברה אינו פועל לבדו, והשותף בכל קצה הוא שקובע את התוצאה.

גם GMP מחזורי שנמדד הוא מדד משולב, ולא בדיקה ישירה של אנזים. רמתו משקפת ייצור על ידי הציקלאז בניכוי פירוק על ידי פוספודיאסטראזות, במיוחד PDE5 בשריר החלק של כלי הדם. לכן, ירידה ב־GMP מחזורי פירושה שפחות אות הגיע לגלאי. היא אינה מזהה כשלעצמה איזו חוליה כשלה.

חוליה 1: נוצר פחות אנזים iNOS

במקרופאגים של עכברים שגּוֹרוּ באמצעות ליפופוליסכריד חיידקי, אינטרפרון גמא או שניהם, מתילן כחול מנע את העלייה הצפויה בחלבון iNOS ודיכא בעוצמה את ה־RNA השליח של iNOS בניסויי השעתוק במקרופאגים. החלק שמספק מידע חשוב הוא דווקא מה שלא השתנה. פירוק המעכב I קפא B אלפא, הזרחון של NF קפא B ושל STAT1, ותנועת הגורמים האלה אל הגרעין נותרו ברובם ללא שינוי. מה שפחת היה הקישור שלהם ל־DNA, כפי שאומת באמצעות אימונופרסיפיטציה של כרומטין שהראתה ירידה בתפוסה בפרומוטר של iNOS.

זו השפעה על ויסות גנים במעלה המסלול הקובע את כמות האנזים, ולא חסימה מיידית של אנזים קיים. היא שייכת לאיתות דלקתי, שבו גורמי שעתוק חייבים להיקשר לפרומוטר לפני שהחלבון מופיע. היא אינה אומרת דבר ישיר על eNOS קונסטיטוטיבי בכלי דם במנוחה, ויש לתאר אותה בהתאם.

חוליה 2: אנזים ה־NOS הקיים פועל לאט יותר

מחקר בחולדות בדק רמה אחרת. חולדות זכרים בהכרה קיבלו ליפופוליסכריד דרך הווריד, וכעבור שלוש שעות קיבלו תמיסת מלח או מתילן כחול במינון של 3 mg לכל kg דרך הווריד. פעילות סינתאז של תחמוצת החנקן בהיפותלמוס הבזאלי המדיאלי נמדדה באמצעות המרת ארגינין מסומן לציטרולין במחקר פעילות ה־NOS בהיפותלמוס. דחק יחד עם תמיסת מלח בלבד השרו פעילות מסוימת שאינה תלויה בסידן, וליפופוליסכריד העלה אותה לכפי עשרה מרמת הביקורת. מתילן כחול ביטל את שני הרכיבים המושרים. הפעילות הקונסטיטוטיבית התלויה בסידן לא השתנתה ברקמה זו, במינון ובנקודת הזמן האלה.

יש לקרוא את התוצאה בדיוק כפי שנכתבה: דיכוי הפעילות הנמדדת מסוג iNOS בתנאים האלה. זו אינה מדידה של ביטוי גנים, וגם לא הוכחה לסלקטיביות קבועה ל־iNOS על פני eNOS או nNOS. עבודה עם אנזים מטוהר מחדדת את הצורך בזהירות. בבדיקות ישירות של סינתאז מטוהר של תחמוצת החנקן, מתילן כחול חסם לחלוטין יצירת ציטרולין בריכוז של 30 מיקרומולר, עם ריכוז מעכב למחצה של כ־5.3 מיקרומולר ללא סופראוקסיד דיסמוטאז ושל 9.2 מיקרומולר בנוכחותו, כפי שדווח בהשוואה בין NOS מטוהר לגואנילאט ציקלאז. מחקר נפרד ב־nNOS מטוהר הצביע על מעורבות של חמצון קבוצת ההם הקשורה לאנזים. הלקח המעשי הוא שעיכוב ישיר של NOS אכן קיים במערכות מבודדות, אך אי אפשר להרחיב את תוצאת ההיפותלמוס לטענה כללית שלפיה מתילן כחול אינו פוגע בשום NOS קונסטיטוטיבי, בכל מקום.

חוליה 3: תחמוצת החנקן אובדת לפני שהיא מגיעה

ההדגמה הברורה ביותר לכך שמנגנון שאינו חסימת אנזים יכול להסביר ירידה ב־GMP מחזורי מגיעה מתאי שריר חלק של עורק הריאה של ארנב שגודלו בתרבית. מערך הניסוי עקף לחלוטין את ה־NOS האנדוגני באמצעות הוספה ישירה של תורמי תחמוצת החנקן, ואז בדק אם מתילן כחול עדיין מדכא את תגובת ה־GMP המחזורי במחקר הסופראוקסיד בשריר החלק של כלי הדם.

שלושה תורמים נבדקו בריכוזים של 1 עד 100 מיקרומולר: S ניטרוזו L ציסטאין, נתרן ניטרופרוסיד ואנלוג יציב שעבר דה־אמינציה בשם MPANO. כולם העלו את ה־GMP המחזורי בערך פי 1.5 עד פי 12. מתילן כחול בריכוז של 10 מיקרומולר עיכב את השניים הראשונים ב־51 עד 100 אחוז, והותיר את התגובה ל־MPANO ללא שינוי. אילו מתילן כחול פשוט חסם את האתר הקטליטי של הציקלאז, היה קשה להסביר את הסלקטיביות הזאת בין התורמים, משום ששלושתם מתכנסים לאותו אנזים במורד המסלול.

שלוש בדיקות ביקורת ייחסו לאחר מכן את המנגנון לסופראוקסיד. ראשית, יצירת סופראוקסיד חוץ־תאי באמצעות קסנתין יחד עם קסנתין אוקסידאז שחזרה את אותו דפוס: CYSNO וניטרופרוסיד נחסמו, ו־MPANO לא נפגע. שנית, מתילן כחול גרם לתאי השריר החלק לייצר סופראוקסיד באופן תלוי מינון וזמן, כפי שנמדד באמצעות חיזור ציטוכרום c. שלישית, סופראוקסיד דיסמוטאז מנע לחלוטין את העיכוב, בעוד קטלאז לא מנע אותו. ממצא זה מצביע על סופראוקסיד, ולא על מי חמצן, כגורם הישיר במערכת הניסוי הזאת.

כדאי לתאר גם את גרסת הניסוי בתרבית משותפת, משום שהיא ממקמת את ההשפעה במרחב. תאי אנדותל על זכוכיות כיסוי גודלו לזמן קצר בתרבית משותפת עם תאי שריר חלק, כך שגורם אנדותליאלי שהשתחרר בתנאי בסיס העלה את ה־GMP המחזורי בשריר החלק פי שלושה עד שמונה. טיפול מקדים במתילן כחול באחד משני המדורים הפחית את האות הזה, וסופראוקסיד דיסמוטאז השיב חלקית את האות לאחר טיפול מקדים בתאי האנדותל. במילים אחרות, מתילן כחול אינו חייב לפעול בתוך תא השריר החלק המשמש כגלאי. הוא יכול להפחית את האות באמצעות סילוק השליח בדרכו. המדריך לקריאת מחקרים על מתילן כחול מציג זאת ככלל כללי: יש לציין את המדור שבו התרחשה ההתערבות לפני שמציינים מטרה מולקולרית.

יהיה שגוי לכנות זאת עיכוב NOS. פעולת התורמים לא דרשה שום שלב של סינתאז, ובכל זאת האות פחת.

חוליה 4: הגלאי עצמו מגיב פחות

קיימות השפעות ישירות על גואנילאט ציקלאז מסיס, אך לריכוזים יש חשיבות. בהשוואת האנזימים המטוהרים שצוטטה לעיל, נדרש ריכוז של כ־60 מיקרומולר מתילן כחול כדי לעכב למחצה ציקלאז שגורה על ידי תחמוצת החנקן, לעומת עיכוב למחצה של NOS בסביבות 5 עד 9 מיקרומולר. אפילו 1 מילימולר הביא רק לחסימה מרבית חלקית. זהו הבדל של פי שישה עד אחד־עשר בקירוב. לכן, אי אפשר להגדיר ניסוי בתאים בריכוז מיקרומולרי נמוך שמפחית GMP מחזורי כעיכוב סלקטיבי של הציקלאז על סמך ערך ה־GMP המחזורי בלבד.

מחקר חמצון־חיזור מאוחר יותר הוסיף הסתייגות שנייה: מתילן כחול השבית ציקלאז שהופעל על ידי תחמוצת החנקן במנגנון שונה מחמצון פשוט של ברזל ההם באוויר. כלומר, תפקוד הגלאי עלול להיפגע, אך הכימיה עדיין אינה ברורה במלואה, ופער הריכוזים פירושו שבחשיפות בריכוזים מיקרומולריים נמוכים ראוי לשלול תחילה את השפעות הסופראוקסיד וה־NOS. כאן נדרשת גם בקרה על פוספודיאסטראזות. אם הפירוק לא נמדד או נחסם, הצטברות מופחתת של GMP מחזורי יכולה להתאים לייצור מופחת, לפירוק מהיר יותר או לשניהם.

מדוע אי אפשר לצמצם זאת לטענה אחת על לחץ דם

כל חוליה הודגמה במערכת אחרת. שעתוק במקרופאגים אינו פעילות אנזימטית בהיפותלמוס. פעילות בהיפותלמוס לאחר ליפופוליסכריד אינה טונוס אנדותליאלי במנוחה. גורם אנדותליאלי המשתחרר בתנאי בסיס בתרבית משותפת אינו הרחבת כלי דם בעקבות גירוי באגוניסט. תאי עורק ריאה בתרבית בריכוז של 10 מיקרומולר מתילן כחול אינם מחזור דם אנושי. דחיסת כל אלה לאמירה כגון מתילן כחול מעלה לחץ דם באמצעות חסימת תחמוצת החנקן מבטלת בדיוק את ההבחנות שבדיקות הביקורת נועדו לשמר.

שלוש בדיקות שומרות על דיוק ההסבר. ראשית, יש לציין את האיזופורם: eNOS לטונוס כלי הדם במנוחה, iNOS לשטף מושרה בהקשר דלקתי, ו־nNOS להקשרים עצביים ולחלק מההקשרים של אנזים מטוהר. שנית, יש לציין כיצד מגיע אות תחמוצת החנקן: ייצור אנדוגני, שחרור אנדותליאלי בתנאי בסיס או תורם מסוים כגון CYSNO, ניטרופרוסיד או MPANO, שכן התורם היציב היה עמיד למתילן כחול ואילו התורמים הלא־יציבים לא היו עמידים. שלישית, יש לציין את הריכוז ואת שחזור התגובה: שחזור באמצעות סופראוקסיד דיסמוטאז מצביע על מעורבות סופראוקסיד; כישלון קטלאז פועל נגד הסבר המבוסס על מי חמצן במערכת הניסוי הזאת; שחזור ההשפעה באמצעות קסנתין אוקסידאז מראה שמנגנון זה מספיק כדי ליצור אותה; ובדיקות באנזימים מטוהרים מפרידות בין השפעות ישירות על הקטליזה לבין אובדן האות בדרכו.

הסיכום התמציתי הוא זה: עדיף להתייחס למתילן כחול כאל גורם המשבש את מסלול האיתות מתחמוצת החנקן ל־GMP מחזורי בכמה אתרים, ולא כאל חוסם סלקטיבי של ציקלאז. בהתאם למערכת הניסוי ולריכוז, הוא יכול להפחית קישור של גורמי שעתוק של iNOS, לעכב ישירות אנזימי NOS, להפחית את זמינות תחמוצת החנקן באמצעות יצירת סופראוקסיד, ולפגוע בציקלאז המופעל על ידי תחמוצת החנקן. תפקיד איתות ה־GMP המחזורי במחקרי כלי דם וההשוואה בין תורמי תחמוצת החנקן המשמשים בבדיקות בתאים עוסקים כל אחד באחד מהענפים האלה ביתר פירוט, והשיטות המשמשות להפרדה בין השפעות חמצון־חיזור להשפעות על אנזימים מסבירות מדוע השילוב של סופראוקסיד דיסמוטאז, קטלאז ותורם יציב כביקורת מופיע לעיתים קרובות כל כך בספרות זו.

ערך נמוך של GMP מחזורי לאחר מתילן כחול מעיד על שרשרת שנקטעה. רק בדיקות הביקורת מגלות איזו חוליה נקטעה.