מדידת ההשפעות של מתילן כחול על מיטוכונדריה: חמצן, ATP ופוטנציאל הממברנה

נניח שמעבדה מוסיפה מתילן כחול למיטוכונדריה שנשימתן פגועה, וצופה בעלייה בצריכת החמצן. המשפט המתבקש הוא שהצבען השיב את התפקוד המיטוכונדריאלי. ייתכן שהמשפט הזה שגוי. שטף חמצן, סינתזת ATP ופוטנציאל ממברנה הם שלושה מושגים נפרדים. הם קשורים לאותו אברון כפי שגיבוי, סנכרון ושיתוף קשורים לאותה תיקייה בענן: יש ביניהם קשר, אבל כל אחד כפוף לכללים אחרים. אם מבלבלים ביניהם, הפרשנות נכשלת, גם כשכל המדידות נכונות מבחינה טכנית.

מתילן כחול מגביר את הסיכון לבלבול משום שהוא משתתף במערכת שאותה מודדים. הוא עובר מחזורי חמצון־חיזור שבהם הוא מקבל אלקטרונים במעלה המסלול ומוסר אותם במורדו, הוא קטיון ליפופילי המצטבר במיטוכונדריה בעלות פוטנציאל ממברנה, והוא תרכובת כחולה בעלת צבע עז, שבולעת ופולטת אור באותם תחומי ספקטרום שבהם פועלים גלאים נפוצים. מדידה יחידה אינה יכולה לתת מענה לכל אלה. הגישה האמינה, שהודגמה במחקרי המיטוכונדריה של קבוצת בודפשט, היא למדוד שטף חמצן לצד קצב סינתזת ATP, פוטנציאל ממברנה ושחרור מי חמצן, עם בקרות ייעודיות לצבען בכל שלב.

רספירומטריה מודדת שטף חמצן, לא תפוקת אנרגיה

רספירומטריה ברזולוציה גבוהה, בין שבאמצעות Oroboros Oxygraph ובין שבאמצעות מנתח השטף החוץ־תאי Seahorse, מדווחת על דבר אחד: באיזו מהירות החמצן מחוזר. היא אינה מדווחת כמה פרוטונים נשאבו לכל אלקטרון, כמה מהמפל נשמר, או אם ATP סינתאז ניצל אותו.

למינוח יש חשיבות. במיטוכונדריה מבודדות, סובסטרט ללא ADP מניב נשימת דלף, סובסטרט עם ADP בריכוז רוויה מניב את קיבולת הזרחון החמצוני, וטיטרציה של חומר מנתק צימוד מניבה את קיבולת העברת האלקטרונים המרבית. בתאים שלמים, המדדים המקבילים של Seahorse הם נשימה בסיסית, נשימה הקשורה ל־ATP ורגישה לאוליגומיצין, דליפת פרוטונים, נשימה מרבית המוגדרת באמצעות FCCP, וצריכת חמצן לא־מיטוכונדריאלית העמידה לרוטנון ולאנטימיצין. כינוי תוצאות Seahorse בשמות State 3 ו־State 4 מייחס להן רמת דיוק שמערכת הניסוי אינה מאפשרת, כפי שמבהירה מסגרת Mito Stress Test של Agilent.

מתילן כחול שובר את הקשר האינטואיטיבי בין יותר חמצן ליותר אנרגיה. במיטוכונדריה מבודדות ממוח של שרקן, צבען בריכוז 100 nM עד 1 uM העלה את צריכת החמצן במנוחה עם הסובסטרטים גלוטמט ומלאט, סוקצינאט ואלפא־גליצרופוספט, עם עלייה של כ־64 אחוז בשימוש באלפא־גליצרופוספט. עם זאת, הנשימה המגורה באמצעות ADP במיטוכונדריה תקינות נותרה למעשה ללא שינוי, לפי המחקר במיטוכונדריה מבודדות מהמוח. מכיוון שנשימת הדלף עלתה בעוד שהשטף המגורה באמצעות ADP נשאר קבוע, יחס הבקרה הנשימתית המחושב יורד. הירידה אינה אומרת שהצבען פגע במיטוכונדריה. היא אומרת שהצבען הוסיף מחזור חמצון־חיזור הצורך חמצן לצד הנשימה הרגילה. בדיקת צריכת חמצן עם מתילן כחול שמדווחת רק על העלייה מדדה תהליך כימי אמיתי, אך לא אמרה דבר על שימור אנרגיה.

ניסויי השבת התפקוד מראים את אותו הפער בקנה מידה גדול יותר. כאשר קומפלקס I נחסם, שטף החמצן התאושש בערך פי שלושה, בעוד שסינתזת ATP התאוששה רק בערך פי 1.5. יותר חמצן הגיע לאלקטרודה. חלק קטן יותר ממנו תרם לייצור ATP. כל טענה לשיפור בזרחון החמצוני מחייבת גם את הצד של ATP במאזן, רצוי כיחס ATP לחמצן, תוך ציון המוסכמה ששימשה להגדרת המכנה.

בדיקות ATP מודדות קצב סינתזה, ותכולה אינה תחליף לכך

בדיקת ATP עונה על שאלה אחרת: כמה ATP נוצר ליחידת זמן. מדידה קינטית, בין שבאמצעות מעקב לאורך דקות אחר לומינסנציה של לוציפראז גחליליות ובין שבאמצעות בדיקה מצומדת של הקסוקינאז וגלוקוז־6־פוספט דהידרוגנאז הנקראת ב־340 nm, מניבה קצב. מדידה יחידה של ATP כולל בנקודת סיום מניבה תכולה, המשקפת סינתזה פחות צריכה, וכשלעצמה מספקת מעט מידע על זרחון חמצוני.

קבוצת בודפשט השתמשה בשיטה האנזימטית המצומדת תוך דיכוי אדנילאט קינאז, ומצאה שמתילן כחול בריכוז 1 עד 2 uM העלה את ייצור ה־ATP במידה מתונה אך מובהקת במיטוכונדריה שטופלו ברוטנון ובאנטימיצין. זו השבת תפקוד אמיתית, והיא חלקית. מחקר רעילות TEGDMA הגיע לתוצאה בעלת אותו דפוס במודל אחר: המונומר הדנטלי TEGDMA בריכוז 5 mM הפחית בחדות את הנשימה הקשורה לקומפלקס I מכ־286 לכ־28 יחידות שטף, וצבען בריכוז 2 uM השיב אותה לכ־86.

שתי בקרות הן הכרחיות כשעובדים עם תרכובת צבעונית הפעילה בחמצון־חיזור. ראשית, יש לבצע בדיקה עם אוליגומיצין כדי לקבוע איזה חלק מסינתזת ה־ATP הנמדדת תלוי ב־ATP סינתאז. שנית, יש לבצע בדיקת שחזור לאחר הוספת כמות ידועה של ATP במערכת ללא תאים, עם תערובת הריאגנטים המלאה ובריכוזי הצבען המדויקים שבהם נעשה שימוש, לכל הפחות 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM ו־2 uM. הצבען עלול לבלוע את האור הנפלט, לעכב את האנזים המדווח או לשנות את כימיית החמצון־חיזור של הריאגנטים. ההנחיות הכלליות לבדיקות לוציפראז ממליצות על בדיקות בקרה ביוכימיות משלימות בדיוק לסוג זה של הפרעה. אין להניח שב־1 uM אין ארטיפקטים רק משום שכיבוי פלואורסצנציה בדרך כלל חמור יותר בריכוזים גבוהים יותר.

גלאי פוטנציאל ממברנה מודדים את פיזור הצבען, לא שטף

ספרנין O, ‏TMRM ו־TMRE, רודמין 123 ו־JC-1 הם כולם קטיונים חדירי ממברנה. הם מצטברים במטריקס בעל המטען השלילי בהתאם לשיווי משקל אלקטרוכימי, ולכן הפלואורסצנציה הכוללת מדווחת בעקיפין על הפוטנציאל דרך מיקומו של הגלאי. אף אחד מהם אינו מודד ATP או שטף אלקטרונים.

לכל גלאי יש מערכת ניסוי מועדפת. ספרנין O מתאים למיטוכונדריה מבודדות ולתאים שהממברנה שלהם הוחדרה, בדרך כלל בריכוז הקרוב ל־2 uM, עם עירור סמוך ל־495 nm ופליטה סמוכה ל־585 nm. הוא פועל במצב של כיבוי פלואורסצנציה, שבו הקליטה משנה את הפלואורסצנציה הכוללת. TMRM ו־TMRE מתאימים לתאים שלמים בהעמסה נמוכה בטווח הננומולרי ובמצב ללא כיבוי פלואורסצנציה, שבו דה־פולריזציה משחררת את הצבען והפלואורסצנציה המיטוכונדריאלית יורדת; בהעמסה גבוהה, כיוון האות עלול להתהפך עקב כיבוי עצמי. JC-1 מספק יחס נוח בין ירוק לאדום, אך תלוי בהעמסה ובמסה המיטוכונדריאלית, ולכן מתאים פחות לעבודה כמותית מאשר TMRM בתנאי בקרה קפדניים. שיקולים אלה מסוכמים בסקירה נפוצה של גלאי פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלית.

מתילן כחול גורם להפרעה אופטית בדיוק בריכוזי העבודה. פסי הבליעה שלו, בסביבות 600 עד 665 nm, חופפים לפליטה האדומה של הגלאים, ולכן אפקט המסנן הפנימי, כיבוי פלואורסצנציה ובליעת אור העירור הם כולם אפשרויות סבירות. הצבען הוא גם קטיון ליפופילי נוסף, שפיזורו משתנה בהתאם לפוטנציאל הנמדד. ההגנה היא שילוב של מדידות משלימות ודגימות בלנק: גלאי בלבד, צבען בלבד, גלאי עם כל אחד מריכוזי הצבען, דה־פולריזציה מלאה באמצעות FCCP כנקודת ייחוס לאפס, ורצוי גם גלאי שני בעל מאפיינים אופטיים שונים. מחקר מעקף קומפלקס III הציב תקדים לכך כשחזר על מדידת השבת פוטנציאל הממברנה הן עם ספרנין O והן עם TMRM לאחר עיכוב באמצעות אנטימיצין ומיקסותיאזול, וקיבל אותה התאוששות איכותנית. מדווח אופטי אחד הוא רמז. שני מדווחים בלתי תלויים הם ראיה.

שלוש מערכות ניסוי, שלוש שאלות שונות

מיטוכונדריה מבודדות, תאים שהממברנה שלהם הוחדרה ותאים שלמים אינם רמות רגישות שונות של אותה בדיקה. אלה מערכות שונות בעלות עקרונות פעולה שונים.

מיטוכונדריה מבודדות משמרות את שרשרת העברת האלקטרונים, הממברנה הפנימית והמנגנונים במטריקס, תוך הסרת ממברנת התא, הציטוזול ומבנה הרשת. ההסרה הזו היא המטרה: הסובסטרטים, ADP, המעכבים וריכוזי הצבען מוגדרים במדויק, ולכן אפשר לזהות את המסלול המעורב. המחיר הוא אובדן אספקת הסובסטרטים הטבעית, האיתות והדרישה האנרגטית.

בתאים שהממברנה שלהם הוחדרה, המיטוכונדריה נשארות בתוך חלק ניכר מהמבנה התאי, בעוד שסובסטרטים ממקור חיצוני ו־ADP יכולים לעבור דרך ממברנת התא שנפתחה. אלה הכלים המתאימים לשיוך פגם למסלול סובסטרט בתוך הקשר תאי. חדירות יתר פוגעת בממברנה החיצונית של המיטוכונדריה, והבקרה הציטוזולית אובדת בעקבות השטיפה.

תאים שלמים משמרים הכול: את מחסום ממברנת התא, המחזרים הציטוזוליים, ההובלה האנדוגנית של סובסטרטים, הרשת המיטוכונדריאלית והדרישה ל־ATP. הם הקרובים ביותר לפיזיולוגיה והרחוקים ביותר מבידוד המנגנון, משום שקליטת הצבען, חיזורו ולכידתו במדורים משפיעים כולם על החשיפה המיטוכונדריאלית בפועל.

מחקר TEGDMA השתמש במכוון בכל שלוש הרמות: מיטוכונדריה מבודדות מהמוח לבדיקת השבת החמצון והפוטנציאל באמצעות הצבען, תאי גזע ממוך השן שהממברנה שלהם הוחדרה בעיקר כדי למקם את הפגיעה בחמצון סובסטרטים הקשור לקומפלקס I, ותאי גזע שלמים לבדיקת ההשפעה הפיזיולוגית הכוללת של צבען בריכוז 2 uM על צריכת חמצן מדוכאת. לקוראים המשווים מדידות מיטוכונדריאליות בין מערכות ניסוי, מאמר ההסבר הנלווה על האופן שבו מתילן כחול מעביר אלקטרונים דרך שרשרת הנשימה מספק את הרקע למסלולים, והמדריך לקריאת מחקרי נשימה עם מתילן כחול מסביר את ההיגיון בבחירת ריכוזים ומעכבים.

הבקרות הנדרשות לצבען פעיל בחמצון־חיזור

צבען העובר מחזורי חמצון־חיזור מחייב רשימת בקרות ארוכה יותר מזו של מעכב רגיל, משום שהכימיה של הצבען לבדו יכולה לחקות פעילות ביולוגית.

ברספירומטריה, יש לבצע מדידה בתא המכיל תמיסת בופר בלבד כדי להעריך סחיפה, בתא המכיל בופר וצבען ללא חומר ביולוגי, ועם צבען וכל מחזר חוץ־תאי המצוי בבדיקה. בתאים שלמים יש להוסיף רוטנון ואנטימיצין בסוף המדידה כדי להגדיר את צריכת החמצן הלא־מיטוכונדריאלית. חשוב לזכור שצבען מחוזר מתחמצן מחדש באמצעות העברת אלקטרונים לחמצן ליצירת מי חמצן. לכן דגימת בלנק של צבען בלבד ללא תורם אלקטרונים ממעיטה בהערכת צריכת החמצן ללא תאים, המופיעה כאשר NADH או NADPH זמינים.

למדידת מי חמצן, יש להעדיף Amplex UltraRed מכויל עם פראוקסידאז מחזרת על פני צבעני DCFDA לא־בררניים, לאמת באמצעות קטלאז ולבדוק תלות בהארה, משום שהצבען הוא פוטוסנסיטייזר. המחקר במיטוכונדריה מהמוח מצא שעומס מי החמצן עלה ליותר מפי ארבעה כבר בריכוז צבען של 100 nM, בעוד שסילוקם הואט, ושמי החמצן נוצרו ישירות מהצבען המחוזר ללא סופראוקסיד כתוצר ביניים. פרטי בחירת הגלאים ובקרות האור מופיעים במאמר הנלווה על מדידת צורוני חמצן פעילים בניסויים עם צבענים, והשאלה הרחבה יותר מתי מי חמצן פועלים כאות ומתי הם מהווים עומס נדונה לצד מאזן החמצון־חיזור התאי וטענות לגבי נוגדי חמצון.

לבדיקת טענות לגבי מסלולים, יש לבדוק את שני אתרי העיכוב של קומפלקס III: אנטימיצין A באתר Qi ומיקסותיאזול באתר Qo, וכן נקודת סיום של עיכוב קומפלקס IV באמצעות ציאניד. מחקר מוקדם יותר במוח עכבר דיווח שהצבען השיב נשימה שנחסמה באמצעות רוטנון, אך לא נשימה שנחסמה באמצעות אנטימיצין. לעומתו, המחקר המאוחר יותר בשלושה מינים מצא השבת תפקוד חלקית עם שני המעכבים וראיות לחיזור ישיר של ציטוכרום c. יש להתייחס למעקף כאל אפשרות התואמת את הנתונים החדשים יותר, ולא כמנגנון מוכרע, משום שריכוז הצבען, אתר העיכוב, מצב הסובסטרטים ופיזור הצבען משנים כולם את המסלול הנצפה.

מטריצת בחירת בדיקות

השתמשו בטבלה הזו כדי לבחור את המדידה לפי השאלה, ולא להפך.

כדי לבסס טענה משכנעת, המינימום הוא לבדוק את אותם ריכוזי צבען, 100 nM, ‏300 nM, ‏1 uM ו־2 uM, בכל המדידות: שטף חמצן בתנאי דלף, ADP, אוליגומיצין וחומר מנתק צימוד; קצב סינתזת ATP; פוטנציאל ממברנה, רצוי באמצעות שני גלאים; ושחרור מי חמצן לאחר כיול, עם קטלאז ובקרות ללא תאים. יש לדווח על מכלול המדדים המקושרים: שטף חמצן, קצב ATP, ‏ATP לחמצן, פוטנציאל ומי חמצן. כל אחד מהמספרים האלה לבדו הוא מדידה שמחפשת משמעות.