מתילן כחול ואוטופגיה: AMPK, mTOR וניסויים בתאי עצב

דמיינו שאתם עורכים ניסוי בתאים, מוסיפים מתילן כחול ורואים שפס חלבון בשם LC3-II נעשה כהה יותר בתספיג שלכם. מפתה להכריז שהתרכובת ״מגבירה אוטופגיה״ ולהמשיך הלאה. פרשנות כזו מוקדמת מדי. פס LC3-II כהה יותר עשוי להעיד שהתא בונה יותר שלפוחיות לפינוי פסולת, אך הוא עשוי גם להעיד שהשלפוחיות מצטברות מפני ששלב הפינוי תקוע. שתי הפרשנויות מצביעות על כיוונים מנוגדים, והספרות על מתילן כחול בתאי עצב כוללת דוגמאות לשני סוגי הראיות. מאמר זה סוקר מה נמדד בפועל, בדיקה אחר בדיקה.

מאקרואוטופגיה, הצורה שנחקרה כאן, היא מנגנון המחזור הכולל של התא. שק קרומי הנקרא פגופור גדל סביב חלבונים ואברונים שחוקים, נסגר לאוטופגוזום, מתאחה עם ליזוזום, ותכולתו מתפרקת ומשתחררת לשימוש חוזר. תאי עצב תלויים בשגרה הזו משום שהם אינם מתחלקים ואינם יכולים לדלל רכיבים פגומים באמצעות חלוקה. כשהמחזור נעצר, פסולת מצטברת. כשהוא פועל, התא משיב לעצמו אבני בניין בתנאי עקה.

מה הראה ניסוי אחד בתאי היפוקמפוס

המחקר המרכזי על השראת התהליך השתמש בתאי היפוקמפוס מעכבר מסוג HT22, שנחשפו לעקה באמצעות מניעת סרום במשך 24 שעות. מצב זה מסיר גורמי גדילה ואותות טרופיים ומעורר הן אפופטוזיס והן אוטופגיה. החוקרים דיווחו שמתילן כחול הפחית מוות תאי באופן תלוי ריכוז, ושהגנה זו לוותה בסימנים למאקרואוטופגיה.

דפוס הסמנים היה מוגדר היטב. צביעת LC3B מפושטת התארגנה מחדש למוקדים סביב הגרעין, החל מריכוז של כ-20 nM מתילן כחול, והתגובה החזקה ביותר של LC3-I ו-LC3-II נצפתה בסביבות 1 μM. גם LC3B-I וגם LC3B-II עלו באופן תלוי ריכוז וזמן. חשוב במיוחד שהצוות התקדם צעד מעבר לתספיג LC3 סטטי. החוקרים הוסיפו 10 μM כלורוקווין, החוסם פינוי ליזוזומלי, ומצאו רמות גבוהות יותר של LC3-II לצד התייצבות של p62 בתאים שטופלו במתילן כחול. דפוס זה תומך בתחלופה תלויה בליזוזומים ולא בהצטברות בלבד. הם גם הראו שכלורוקווין ביטל חלקית את ההשפעה נוגדת האפופטוזיס, ממצא הקושר את ההגנה למסלול האוטופגיה והליזוזומים במודל זה.

תוצאת האיתות היא החלק שמצוטט באופן שגוי בתדירות הגבוהה ביותר. איתות AMPK, שנמדד באמצעות AMPK מזורחן ומטרתו במורד המסלול, ACC מזורחן, עלה לאחר 12 ו-24 שעות באופן תלוי ריכוז. מעכב AMPK בשם Compound C, שניתן בריכוז של 20 μM במהלך 4 השעות האחרונות, הפחית הן את זרחון ACC והן את הפעלת LC3. לעומת זאת, לא נמצא דיכוי ניתן לזיהוי של mTOR מזורחן. לכן, בתאי היפוקמפוס בתנאי עקה, הממצא היה השראת התהליך הקשורה ל-AMPK דרך מסלול שנראה בלתי תלוי ב-mTOR. אותו דפוס הופיע בעכברים חיים, שבהם טיפול במתילן כחול השרה סמני מאקרואוטופגיה בקליפת המוח ובהיפוקמפוס.

השראת התהליך אינה זרימה שהושלמה

כאן ההבחנה המושגית חשובה במיוחד. השראה פירושה שהמנגנונים במעלה המסלול מייצרים יותר אוטופגוזומים. זרימה פירושה שהתכולה עוברת את המסלול כולו: לכידה, הבשלה, איחוי עם ליזוזום, פירוק ומחזור. כל עלייה ב-LC3-II היא בגדר טענה להשראת התהליך עד שבדיקת זרימה מאשרת את יתר שלבי הדרך.

בדיקת הזרימה המקובלת מודדת LC3-II עם ובלי חסימה ליזוזומלית קצרה, כגון באמצעות באפילומיצין A1 או כלורוקווין. אם הטיפול אכן מאיץ את הייצור, חסימת הפירוק אמורה להעלות את LC3-II עוד יותר. מערכת דיווח טנדם מסוג mCherry-GFP-LC3 מוסיפה נקודת מבט נוספת: המבנים זוהרים בצהוב לפני האיחוי עם הליזוזום, ובאדום בלבד לאחר שהסביבה החומצית מכבה את אות ה-GFP. לכן, ריבוי מוקדים אדומים בלבד תומך בהתקדמות לאוטוליזוזומים חומציים. ירידה בחלבון p62 יכולה לחזק את הראיות לתחלופת התכולה, אך יש לזכור שגם השעתוק של p62 עצמו מגיב לעקה, ויש לבדוק אותו ברמת ה-mRNA.

רשימת הבדיקה שלהלן ממפה כל בדיקה ששימשה בספרות זו למה שהיא מודדת ולמה שאינה יכולה להוכיח לבדה. הקוראים יכולים להשתמש בה לבחינת כל טענה עתידית על מאקרואוטופגיה, לרבות טיעונים על צום ואריכות ימים הנשענים על סמנים אלה.

שימו לב למלכודת ניסוח אחת שהטבלה מסייעת להימנע ממנה. ACC מזורחן הוא הצורה המעוכבת מבחינה אנזימטית. עלייתו מעידה על פעילות במורד מסלול AMPK, ולא על הפעלת ACC.

הביטוי ״עיכוב מאקרואוטופגיה ביטל את ההגנה העצבית״ מחייב אותה מידת דיוק. במודל HT22 פירושו ששיבוש מסלול האוטופגיה והליזוזומים הסיר את יתרון ההישרדות שהעניק מתילן כחול בתנאי מניעת סרום. הוא תומך בכך שאוטופגיה נחוצה או תורמת באותה תרבית. הוא אינו מבסס את האוטופגיה כמנגנון ההגנה היחיד של התרכובת, אינו מוכיח שכלורוקווין פועל אך ורק דרך אוטופגיה, ונדרש שיבוש גנטי של ATG5, ATG7 או ULK1 כדי לחזק את הטענה הסיבתית.

שני מסלולים אל אותו מנגנון

מפה מפושטת מסייעת להבין. עקה אנרגטית מגבירה את פעילות AMPK, ‏AMPK מפעיל את קומפלקס ULK1, והאוטופגיה מתחילה. גורמי גדילה וחומרי הזנה מגבירים את פעילות mTORC1, ‏mTORC1 מעכב את ULK1, והאוטופגיה נותרת בלתי פעילה. במורד המסלול של ULK1, הקומפלקס של Beclin-1 ו-VPS34 מתחיל את יצירת הפגופור, LC3-I עובר ליפידציה והופך ל-LC3-II, האוטופגוזום נסגר, מתאחה עם הליזוזום, והתכולה מתפרקת תוך תחלופה של p62.

התרשים ממקם כל ממצא על מתילן כחול במפה זו: התוצאה בתאי ההיפוקמפוס לצד ענף AMPK, והתוצאה בתאי האב לצד ענף mTOR.

מסגרת זו מיישבת את המתח לכאורה מול המחקר השני של Xie. בתאי אב עצביים מתרבים מחולדה, ניסוי נפרד מצא ש-5 μM מתילן כחול עיכבו התרבות וקידמו מצב מנוחה, עם ירידה בתאים חיוביים ל-Ki67 בימים 1 ו-3, בעוד שההתמיינות העצבית של תאים שכבר התחייבו למסלול זה נותרה ללא פגיעה. שם המנגנון פעל דרך דיכוי איתות mTOR: ירידה ב-mTOR הכולל וב-mTOR המזורחן, לצד ירידה בביטוי p70S6K ו-4EBP1, וכן הפחתת ביטוי הציקלינים E1, B1, D1 ו-D2. הפנוטיפ הדומיננטי היה מצב מנוחה של תאי האב, שהמחברים קישרו לעיכוב הזדקנות תאית, ולא להצלת תאי היפוקמפוס בתנאי עקה.

אין סתירה בין שני המאמרים. AMPK ו-mTOR משלבים אותות באופן תלוי הקשר, ואינם מתגים קבועים. תא דמוי תא עצב בתנאי עקה יכול להפעיל AMPK בלי עיכוב מדיד של mTOR, ואילו תא אב המונע על ידי מיטוגנים יכול להגיב לאותה תרכובת באמצעות האטת מנגנוני גדילה התלויים ב-mTOR. סוג התא, הקשר העקה, הריכוז ונקודת הזמן קובעים איזה ענף דומיננטי. זו גם הסיבה שההשפעות של מתילן כחול על האנרגיה במיטוכונדריה ועל תהליכי חמצון־חיזור שייכות לאותה תמונה: כפי שמתארת סקירה מנגנונית של הגנה עצבית, התרכובת פועלת כנשא אלקטרונים חלופי, מפעילה איתות נוגד חמצון ונוגד אפופטוזיס, מעכבת MAO ו-NOS, וקשורה להתחדשות המיטוכונדריה באמצעות ביוגנזה ואוטופגיה. אוטופגיה היא ענף אחד בפרופיל רב־השפעות, ולא הסיפור כולו.

מה הניסויים אינם מראים

מניעת סרום מדמה עקה טרופית ומטבולית בתרבית. היא אינה מדמה צום של אורגניזם שלם: גלוקוז, חומצות אמינו ומלחים נותרים במצע הבסיסי, ואין כל התנהגות אכילה. אי אפשר להמיר ריכוזים בתרבית, מ-20 nM עד 5 μM, למינונים בבני אדם באמצעות חישוב חשבוני, משום שהספיגה, הקישור לחלבונים, מצב החמצון־חיזור, חילוף החומרים, ההצטברות ברקמות ומשך החשיפה שונים כולם.

אף ניסוי בבני אדם לא תוכנן להדגים זרימה אוטופגית המושרית על ידי מתילן כחול במטופלים. הראיות המנגנוניות עדיין מבוססות על עבודה בתאים, מחוץ לגוף ובבעלי חיים, וסקירות עדיין מתארות את הראיות ליישום קליני כראשוניות. לכן, מחקרים אלה אינם מראים שמתילן כחול משחזר צום, מאריך את תוחלת החיים האנושית באמצעות אוטופגיה, או מביא להשלמת הזרימה האוטופגית במוח האנושי. טענות על חיקוי צום ועל אריכות ימים זקוקות לראיות קליניות משלהן, וניסויים במתילן כחול בבני אדם להתוויות אחרות אינם הופכים לניסויי אוטופגיה מכוח הקישור בלבד. יש לקרוא מחקרים על מודלים של עקה עקב מחסור בחומרי הזנה ועל אריכות ימים מתוך מודעות לגבול הזה.

במאמר הבא שתקראו, יישמו את רשימת הבדיקה לפי הסדר. תחילה שאלו באיזה ענף חל שינוי: AMPK, ‏mTOR או אף אחד מהם. לאחר מכן שאלו אם תוצאת LC3 לוותה בבדיקת זרימה או שהיא עומדת לבדה. לבסוף בדקו אם חסימת המסלול ביטלה את התועלת, ובאיזו שיטה. מחקר שעונה על כל שלוש השאלות מצדיק טענה מנגנונית חזקה. מחקר שעונה רק על הראשונה הראה אות המאפשר את התהליך, ושאר הדרך נותרה בלתי ממופה.