מדוע משתמשים במתילן כחול כצבע ניגוד בצביעה לעמידות לחומצה

טכנאי בוחן משטח כיח לאחר השלמת כל שלבי הצביעה. מתגים אדומים בולטים על רקע כחול, והדוח נמסר בנוסח: נראו מתגים עמידים לחומצה. למחרת, זכוכית נושא אחרת מציגה שדה כחול אחיד ללא מתגים אדומים, והתוצאה מדווחת כשלילית לשחפת. אחד הדוחות האלה קובע יותר ממה שזכוכית הנושא מאפשרת להסיק, וזה אינו הדוח הראשון.

הבלבול הוא מושגי. הטכנאי התייחס לצבע הכחול כחלק מכימיית הזיהוי, כאילו מתילן כחול סייע למצוא את המיקובקטריות. הוא לא סייע בכך. כשהמתילן הכחול נוגע בזכוכית הנושא, המבחן כבר הסתיים. הצבע רק צובע את הרקע כדי שאפשר יהיה לקרוא את התוצאה. המאמר הזה מסביר את תפקידו של מתילן כחול בצביעה לעמידות לחומצה, מדוע הוא כחול ולא בצבע אחר, ואילו מסקנות מותר להסיק מאדום על רקע כחול.

התשובה הקצרה

צביעה לעמידות לחומצה היא מבחן מבדיל המבוסס על שלושה עקרונות. קרבול פוקסין, הצבע הראשוני, מוחדר בכוח לכל תא, לרבות מיקובקטריות בעלות מעטפת שעוותית. חומצה־אלכוהול, חומר הסרת הצבע, מסירה את הצבע האדום מתאים רגילים, אך אינה מצליחה לחלץ אותו מתאים עמידים לחומצה. לאחר מכן, מתילן כחול, צבע הניגוד, צובע את כל מה שחומר הסרת הצבע רוקן מצבע. כך תאים שאינם עמידים לחומצה, תאי המאכסן ושיירים נראים כחולים, בעוד שמתגים עמידים לחומצה נשארים אדומים. צבע הניגוד מספק ניגודיות. הוא אינו משתתף בכימיה שהופכת תא לעמיד לחומצה.

מה עושה כל שלב

התרשים שלהלן מציג את חלוקת התפקידים. קראו אותו משמאל לימין כתהליך עבודה, ואת הרצועה התחתונה כתזכורת לכך שכל משפחת שיטות צביעה עונה על שאלה אחרת.

החדירה היא השלב הראשון. מיקובקטריות מתנגדות לחדירת צבעים מימיים רגילים משום שהמעטפת שלהן הידרופובית במידה חריגה, ולכן הפרוטוקול מאלץ את הצבע להיכנס. בשיטת ציל־נילסן, חימום עד להופעת אדים מניע קרבול פוקסין המכיל פנול דרך הדופן השעוותית. בשיטת קיניoun הקרה, החימום מוחלף בתכשיר צבע ראשוני מרוכז הרבה יותר, ובכמה גרסאות מותאמות ללא חימום מוסיפים חומרים פעילי שטח. הפרוטוקולים לצביעה לעמידות לחומצה של האגודה האמריקאית למיקרוביולוגיה מתעדים את שני ההרכבים זה לצד זה, והבדל הריכוזים בולט: כ־0.3 g פוקסין בסיסי לכל 100 mL בשיטה המחוממת, לעומת כ־4 g בשיטה הקרה.

ההבחנה היא השלב השני. חומצה־אלכוהול, לרוב 3 mL חומצה הידרוכלורית מרוכזת בתוך 97 mL אתנול בריכוז 95 אחוז, שוטפת את הצבע האדום מכל תא שדופנו אינה מציעה עמידות מיוחדת. תאים בעלי מעטפת ליפידית מיקובקטריאלית שלמה שומרים על הצבע. זהו השלב שעליו נשענת השיטה כולה, והוא גם הרגיש ביותר לאופן הביצוע, כפי שיפורט בהמשך.

הניגודיות מגיעה בסוף. כעת נמצאים על זכוכית הנושא תאים אדומים עמידים לחומצה על רקע כמעט חסר צבע של תאים שצבעם הוסר. מתילן כחול בריכוז 0.3 אחוז w/v מחזיר לרקע את הנראות, בצבע השונה ככל האפשר מאדום. צביעת הניגוד קצרה, בדרך כלל 20 עד 30 שניות בשיטה המחוממת ועד כמה דקות בחלק מגרסאות השיטה הקרה. משך הצביעה תלוי בפרוטוקול ואינו תכונה של הצבע עצמו.

מדוע דווקא הצבע הזה, ומדוע כחול

מתילן כחול הוא צבע בסיסי קטיוני, כלומר היון הצבעוני שלו נושא מטען חיובי ונקשר למשטחים בעלי מטען שלילי של חיידקים שצבעם הוסר, תאי המאכסן ושיירים. ספר המיקרוביולוגיה של OpenStax מתאר את עקרון המטענים הזה כעיקרון הכללי שמאחורי צבעים בסיסיים. אבל מתילן כחול אינו ייחודי כאן מבחינה כימית. גם קריסטל ויולט וספרנין הם צבעים בסיסיים. הבחירה היא אופטית, לא כימית.

מתגים אדומים זקוקים לרקע בגוון מנוגד, וכחול מספק ניגוד לאדום באופן המועיל ביותר למיקרוסקופיית שדה בהיר. ספרנין יהיה צבע ניגוד גרוע, משום שהגוון הוורוד־אדום הסופי שלו קרוב מדי לקרבול פוקסין שנשמר בתאים, וכך מטשטש את ההבחנה שהתהליך נועד ליצור. קריסטל ויולט ייצור רקע סגול כהה שיתחרה במתגים האדומים הדקים על תשומת הלב. הראיה החזקה ביותר לכך שהתפקיד הוא יצירת ניגודיות ולא פעולה כימית היא האפשרות להחליף את הצבע: צבעי ניגוד ירוקים, כגון ירוק מלכיט וירוק מבריק, משמשים בחלק מהפרוטוקולים הווטרינריים והמותאמים, והמבחן עדיין פועל, משום שכל גוון שונה בבירור ממלא את אותו תפקיד.

מכאן נובעות שתי מסקנות מעשיות. ראשית, ההרכב המקובל אינו מציין התאמת pH; אין לבלבל בין התמיסה המימית הפשוטה הזאת בריכוז 0.3 אחוז לבין תכשירים בסיסיים כגון מתילן כחול של לפלר, השייכים לתפיסת צביעה אחרת. שנית, שימוש מופרז מזיק. ספרות ההיסטולוגיה מזהירה במפורש שרקע כחול צפוף מדי עלול להסתיר מתגים מעטים, ולכן השארת זכוכית הנושא מכוסה בצבע למשך זמן ארוך מהמותר בפרוטוקול פוגעת ביכולת הקריאה ללא כל תועלת.

כימיית הדופן שמאפשרת את המבחן

הסיבה לכך שחומצה־אלכוהול מבחינה בין התאים טמונה במעטפת המיקובקטריאלית. הליבה המבנית שלה היא קומפלקס מיקוליל־ערבינוגלקטן־פפטידוגליקן: פפטידוגליקן המחובר לערבינוגלקטן, שקצותיו החיצוניים נושאים חומצות מיקוליות בעלות שרשראות ארוכות מאוד. אלה יוצרות מיקוממברנה חיצונית עשירה בליפידים, בעלת חדירות נמוכה באופן חריג. הסקירה על הממברנה החיצונית של מיקובקטריות מפרטת את המבנה הזה. המחסום פועל בשני הכיוונים. הוא מתנגד לכניסת הצבע, ולכן החדירה דורשת חימום או צבע ראשוני מחוזק, והוא מתנגד לחילוץ הצבע, ולכן חומצה־אלכוהול אינה מצליחה להסיר את הקרבול פוקסין לאחר שנכנס. לחיידקים רגילים אין מעטפת כזאת, והם מאבדים את הצבע. לכן נכון יותר להבין עמידות לחומצה כתופעה של מחסום ליפידי, ולא כקישור כימי של פוקסין לחומצה מיקולית.

הכימיה הזאת מסבירה גם תופעה מבלבלת נפוצה: מיקובקטריות נצבעות באופן חלש ולא צפוי בשיטת גראם, ולעיתים נראות כצורות חלשות דמויות שרשרת חרוזים או כצלליות בלתי צבועות. הדופן ההידרופובית שלהן מגבילה את חדירת הקריסטל ויולט. צביעה לעמידות לחומצה אינה צביעת גראם מותאמת. היא מבוססת על עיקרון מבדיל אחר, הנשען על תכונה אחרת של הדופן, כפי שמדגימה ההשוואה בין צביעה פשוטה לצביעת גראם עבור שתי השיטות האחרות.

שלוש שיטות, שלוש שאלות

למשפחה הרחבה יותר של שיטות לצביעת חיידקים בצבע יחיד, ראו אטלס הצביעות למיקרוסקופיה.

מה אדום על רקע כחול אינו יכול להוכיח

מתגים אדומים פירושם שהאורגניזמים שמרו על הקרבול פוקסין במהלך החשיפה לחומצה־אלכוהול. הממצא הזה מתיישב עם מיקובקטריום טוברקולוזיס, אך הנחיות CDC לאבחון שחפת מציינות במפורש שגם מיקובקטריות אחרות עמידות לחומצה. לכן זיהוי המין דורש תרבית ובדיקת חומצות גרעין, ולא הסתמכות על צבע.

שגיאות ביצוע נוטות להתרכז בשני שלבי השטיפה. הסרת צבע בלתי מספקת משאירה חומר רקע אדום ועלולה להביא לפענוח חיובי כוזב. הסרת צבע מוגזמת מסלקת צבע ראשוני שנשמר באופן חלש ותורמת לתוצאות שליליות כוזבות. צביעת ניגוד חזקה מדי קוברת מתגים מעטים בתוך הכחול. משטחים עבים, ריאגנטים ששקעו ומי שטיפה מזוהמים מוסיפים ארטיפקטים משלהם.

הרגישות מוגבלת על ידי כמות האורגניזמים, גם כשהביצוע מוקפד לחלוטין. מיקרוסקופיית משטח רגילה דורשת בערך 5,000 עד 10,000 מתגים למיליליטר כיח, וסקירות ראיות קודמות של CDC העריכו את רגישות המשטח בכ־45 עד 80 אחוז בקרב מקרי שחפת ריאתית שאומתו בתרבית. לכן משטח שלילי לעולם אינו שולל שחפת. ההנחיות העדכניות של CDC משאירות את התרבית לצד כל משטח וממליצות על בדיקת הגברה של חומצות גרעין בדגימת נשימה אחת לפחות כאשר נשקלת אפשרות של שחפת ריאתית והתוצאה עשויה לשנות את ההתנהלות הקלינית.

עבודה מעשית חייבת להתבסס על פרוטוקולים מוסמכים

תיאורים לצורכי לימוד, לרבות המאמר הזה, אינם מהווים הרשאה לעבודה קלינית. לעבודה במעבדה, יש לפעול לפי נוהל העבודה הסטנדרטי המתוקף של המעבדה, התואם למסמכים העדכניים של CDC, APHL או CLSI; מסמך הייחוס של CDC לצביעה לעמידות לחומצה, השמור בארכיון Stacks שלו, מדגים כיצד נהלים כאלה מגדירים ריאגנטים ותוצאות לקריאה. עבודה עם דגימות שחפת מחייבת הכלה: משטחים מוכנים במנדף בטיחות ביולוגית, משום שההכנה יוצרת אירוסולים והתזות. הנחיות הבטיחות במעבדה של CDC קובעות שגם משטחים שקובעו בחום עלולים להכיל מתגי שחפת חיים, ולכן עדיין יש לטפל בהם כמזוהמים. הרשומה בספריית תמונות בריאות הציבור של CDC המתארת משטח שנצבע בקרבול פוקסין ובמתילן כחול ונבדק לנוכחות מיקובקטריום לפרה היא תזכורת מועילה לטווח השימוש של השיטה מעבר לשחפת: אותה ניגודיות של אדום על כחול משמשת בכל מקום שבו מחפשים אורגניזמים עמידים לחומצה, וגם פענוח שלילי שנעשה בקפידה הוא תוצאה שכדאי לתעד.

קריאת זכוכית הנושא לאחר הצביעה

צבע הניגוד מצדיק את מקומו במהלך הסריקה. מיקרוסקופאי הסורק בהגדלה נמוכה משתמש תחילה ברקע הכחול כדי להעריך את איכות המשטח: פיזור אחיד של תאים, תאי מאכסן שלמים לצורך מיקוד, והיעדר משקע רב. לאחר מכן, מבנים אדומים חשודים מושכים את העין דווקא משום ששום דבר אחר על זכוכית הנושא אינו אדום. האימות נעשה בטבילה בשמן, שבה מתגים אמיתיים מציגים את המראה הצפוי של מתגים דקים, לעיתים מעט מעוקלים או דמויי שרשרת חרוזים, ולא של שיירי צבע אחידים.

צביעת הרקע קובעת גם את הניסוח בדוח. זכוכית נושא עם מתגים אדומים מדווחת בנוסח: נראו מתגים עמידים לחומצה, לעיתים קרובות עם דירוג כמותי למחצה לפי סולם המעבדה. זכוכית נושא ללא אורגניזמים אדומים מדווחת בנוסח: לא נראו מתגים עמידים לחומצה, ולעולם לא כשלילית לשחפת. ההבחנה חשובה משום שהשדה הכחול מוכיח שהצביעה פעלה, שהתאים קלטו את צבע הניגוד ושהמערכת האופטית הייתה מספקת, אך אינו אומר דבר על אורגניזמים שנמצאים מתחת לסף הגילוי. שדה כחול ללא מתגים הוא תוצאה תקפה לגבי זכוכית הנושא, לא קביעה לגבי המטופל.

זכרו את חלוקת התפקידים, וניסוח הדוחות יהיה ברור מאליו. קרבול פוקסין מזהה מועמדים. חומצה־אלכוהול מבצעת את המבחן. מתילן כחול רק הופך את התשובה לקריאה: האדום שמר על הצבע מול החומצה, והכחול איבד אותו. כל היתר — המין, הכמות והמשמעות הקלינית — נובע מעבודה שמעבר לזכוכית הנושא.