מדידת מיני חמצן תגובתיים בניסויים במתילן כחול

שתי מעבדות עורכות ניסוי שכל אחת מהן מכנה ניסוי בפעילות נוגדת החמצון של מתילן כחול. אחת מדווחת שהצבע מדכא מיני חמצן תגובתיים. האחרת מדווחת שהוא מייצר אותם. שתיהן מציגות עקומות מנה–תגובה ברורות. שתיהן פועלות בתום לב. ההבדל אינו נובע מהונאה או מחוסר מקצועיות. שתי הקבוצות מדדו דברים שונים בתנאי תאורה שונים, באמצעות גלאים שעונים על שאלות שונות, ואז תיארו את שתי התשובות באותו מונח: ROS.

מתילן כחול הוא מולקולה שקשה למדוד במדויק, משום שהיא משתתפת בכימיה שאותה היא אמורה לנטר. בחושך היא מעבירה אלקטרונים בין תורמים למקבלים וחוזרת לצורתה ההתחלתית, מוכנה למחזור נוסף. תחת אור היא הופכת לפוטוסנסיטייזר, ומגיעה למצב טריפלט מעורר שממנו היא יכולה להעביר אנרגיה לחמצן כדי ליצור חמצן סינגלט, או להעביר אלקטרונים כדי ליצור רדיקלים ומי חמצן. כל גלאי שמוכנס למערכת הזאת עלול לעבור חמצון, חיזור, הלבנה או מיסוך אופטי בידי הצבע עצמו. לכן השאלה הראשונה בכל קריאת ROS אינה מהו המספר, אלא מה הבדיקה מזהה בפועל, וכיצד הצבע משפיע על הבדיקה.

Amplex Red: בדיקה מכוילת של מי חמצן

השילוב של מתילן כחול ו-Amplex Red הוא השילוב המבוסס ביותר בספרות הזאת, כאשר הוא מבוצע כראוי. הכימיה ספציפית: פראוקסידאז מחזרת משתמש במי חמצן כדי לחמצן את מצע Amplex לתוצר פלואורסצנטי, רזורופין, בסטויכיומטריה של בערך אחד לאחד. מי החמצן שבדגימה מתורגמים לאות פלואורסצנטי בגלאי. אף מין אחר במשפחת ה-ROS המקובלת אינו מניע את התגובה הזאת ישירות.

היתרון המכריע הוא הכיול. חוקר קפדן בודק תקנים של מי חמצן בריכוזים ידועים באותו בופר, עם אותם ריכוזי פראוקסידאז ומצע, אותו זמן הדגרה ואותן הגדרות אופטיות, ואז קורא את הדגימות ביחס לעקומה הזאת. במחקר על מיטוכונדריה מבודדות מהמוח, שעליו מבוססת השיטה הזאת, המחברים עשו בדיוק כך: הם הוסיפו כמויות ידועות של מי חמצן בסוף כל הרצה, והתוצאות דווחו כקצבים בפיקומול לדקה למיליגרם חלבון, ולא ביחידות פלואורסצנציה שרירותיות. זה מה שהופך זוהר למדידה.

שלושה פרטים מאותו מחקר ראויים לאימוץ. ראשית, המחברים אימתו את האות באמצעות קטלאז, המפרק מי חמצן. העלייה בפלואורסצנציה שגרם מתילן כחול נעצרה עם הוספת קטלאז, ובכך אושר שהאות נבע ממי חמצן ולא מארטיפקט אופטי. שנית, הם בדקו ישירות את השפעת התאורה באמצעות תריס בקרן העירור, כך שהדגימות קיבלו שמינית ממנת האור הרגילה, והאות ירד בתשעה אחוזים בלבד. יותר מתשעים אחוזים ממי החמצן שעליהם דיווחו לא היו תלויים באור המדידה. שלישית, הם מדדו בנפרד את סילוק מי החמצן באמצעות אלקטרודה, ומצאו שהצבע גם הגביר את הייצור וגם האט את הסילוק. גלאי שמדווח רק על פלואורסצנציה נטו היה מערבב בין שתי ההשפעות האלה.

לבדיקה עדיין יש נקודות כשל, ומתילן כחול חושף כמה מהן. הצבע סופג אור בטווח רחב באותו אזור אדום שבו רזורופין פולט אור, ולכן בריכוזי צבע גבוהים הדגימה עלולה למסך את האות של עצמה באמצעות אפקטים של מסנן פנימי. לכן התקנים צריכים להכיל את אותו ריכוז צבע כמו הדגימות. Amplex Red יכול גם לעבור חמצון פוטוכימי בעצמו, והתוצר שלו, רזורופין, יכול להשתתף במחזורי חמצון-חיזור פוטוכימיים שמייצרים סופראוקסיד ומי חמצן. הדבר חשוב במיוחד כאשר הניסוי מאיר גם פוטוסנסיטייזר. הפתרון המעשי הוא להקרין תחילה את דגימות המתילן הכחול, ואז לבדוק מנות מהן באמצעות מגיבי Amplex בחושך, במקום להאיר את הצבע ואת הגלאי יחד. לבסוף, סופראוקסיד דיסמוטאז אינו פשוט מדכא אות Amplex: המרת סופראוקסיד למי חמצן יכולה להגביר אותו. בקרת SOD שמגבירה את הפלואורסצנציה לא נכשלה. היא זיהתה סופראוקסיד כמין שנמצא במעלה מסלול התגובה.

DCFDA: סמן חמצון לא ספציפי

השילוב של מתילן כחול ו-DCFDA הוא המקור לרוב הבלבול. DCFH-DA הוא חומר מוצא המיועד להחדרה לתאים. אסטרזות בתוך התא מסירות את קבוצות האצטט שלו ומשאירות DCFH שאינו פלואורסצנטי, וחמצון של DCFH יוצר DCF פלואורסצנטי. רשימת החומרים שמחמצנים אותו ארוכה: רדיקלי הידרוקסיל, תוצרי ביניים של פראוקסידאז ושל הֵם, חנקן דו-חמצני, חומצה היפוכלורית ורדיקלים שמקורם בפראוקסיניטריט. מי חמצן לבדם אינם מחמצנים אותו ישירות בקצב שימושי כלשהו; פלואורסצנציה התלויה במי חמצן דורשת בדרך כלל מעורבות של ברזל, חלבוני הֵם או כימיה של פראוקסידאז.

הביקורת שכל פרק שיטות צריך לצטט מקורה בניתוח של DCFH כגלאי שערכו Kalyanaraman ועמיתיו, כפי שסוכם במחקר על מיטוכונדריה מהמוח שדחה את השימוש ב-DCFDA מסיבה זו. הם הראו שהגלאי מגיב לאט, בסטויכיומטריה שלא אופיינה, ללא כיול תקף, וגם עם תרכובות שאינן ROS. הגלאי גם מגביר את מה שהוא מודד: חמצון חד-אלקטרוני של DCFH יוצר רדיקל DCF שמגיב עם חמצן ליצירת סופראוקסיד, אשר עובר דיסמוטציה ויוצר מי חמצן נוספים. הקריאה מייצרת בעצמה חלק מהכימיה שעליה היא מדווחת.

כל זה אינו הופך את DCFDA לחסר תועלת. הוא הופך אותו לכלי סריקה, לא לכלי זיהוי. עלייה בפלואורסצנציה של DCF פירושה שחמצון הגלאי התלוי במחמצנים גבר. אין פירושה שמי החמצן עלו, ובוודאי אין פירושה שסך ה-ROS עלה — כמות שאף גלאי יחיד אינו מודד. מחקרים מוקדמים במתילן כחול, שהסתמכו על חמצון DCF בריכוזים מעל מיקרומולר אחד, דיווחו על השפעות מעודדות חמצון, בעוד מערכות אחרות באותה תקופה הצביעו על הגנה מפני מוות תאי שנגרם ממי חמצן. שתי התצפיות יכולות להיות נכונות לגבי אותו צבע בהקשרים שונים של חמצון-חיזור, ותוצאת DCF לבדה אינה יכולה לומר איזה מחמצן היה אחראי לאות. חשיבותו של המחקר המוקדם במיטוכונדריה מהמוח היא בכך שהחליף את הסריקה הזאת במדידה מכוילת של מי חמצן, ומדד את העומס ישירות: אפילו צבע בריכוז של מאה ננומולר הגביר את שחרור מי החמצן פי כמה בכל מצע ובכל מצב נשימתי שנבדקו.

ל-DCFDA יש מלכודת נוספת הייחודית למתילן כחול. לצבע גוון עז והוא פעיל בתהליכי חמצון-חיזור, ולכן הוא יכול להלבין את האות הפלואורסצנטי, לדכא פליטה או לחמצן את הגלאי ללא תלות ב-ROS תאיים. בקרה ללא תאים, המכילה צבע וגלאי בלבד, אינה תוספת קוסמטית שאפשר לוותר עליה. זהו הניסוי שמגלה אם הצבע מקיים אינטראקציה עם הגלאי.

לכידת ספין וצריכת חמצן: זהות ושטף

בעוד הגלאים הפלואורסצנטיים מדווחים שהופיע חומר הניתן לחמצון, תהודת ספין אלקטרונית עם לוכדי ספין מספקת מידע קרוב יותר לזהותו. המחקר הקלאסי על הפוטוכימיה של מתילן כחול השתמש בESR לזיהוי רדיקל האסקורבט בנוכחות צבע, אסקורבט ואור, ובהמשך הדגים יצירת מי חמצן בניסויי צריכת חמצן ויצירת רדיקלי הידרוקסיל המזורזת בידי ברזל בניסויי לכידת ספין. כל טכניקה ענתה על שאלה שהאחרות לא יכלו לענות עליה: ESR סיפק את זהות הרדיקל, צריכת החמצן סיפקה את שטף התגובה ללא תלות בגלאי פלואורסצנטי כלשהו, והשילוב הראה שגם מסלולי חמצן סינגלט וגם מסלולים רדיקליים פועלים באותה מערכת מוארת.

הממצא הזה משנת 1984 עדיין נקרא כתווית אזהרה. בנוכחות תאורה וחומר מחזר, הצבע ייצר מי חמצן, ובנוכחות ברזל המערכת ייצרה רדיקל הידרוקסיל, המין התגובתי ביותר בקבוצה. המחברים קישרו זאת לאסקורבט בעין והטילו ספק בשימוש עיני בלתי מבוקר. קוראים כיום צריכים לשים לב לתנאים: אור יחד עם חומר מחזר ועם ברזל. הסרת כל אחד מהם מחלישה את המסלול או מבטלת אותו.

אלקטרודות חמצן מצדיקות את מקומן בדרך אחרת. אלקטרודה מסוג Clark מודדת צריכת חמצן נטו, ובכך מבססת שכימיית חמצון-חיזור שמניע הצבע צורכת חמצן מולקולרי, ומספקת נתונים קינטיים ששום ארטיפקט פלואורסצנטי אינו יכול לזייף. היא אינה מזהה את התוצר. יצירת מי חמצן, סופראוקסיד ומים, וכן דעיכת חמצן סינגלט, כולן כרוכות בצריכת חמצן. שטף ללא זהות אינו שלם, בדיוק כפי שזהות ללא שטף אינה שלמה, ולכן המחקרים החזקים משלבים את האלקטרודה עם בדיקת מי חמצן מכוילת או עם לוכד.

מדוע תוצאות בנוגע לפעילות נוגדת חמצון סותרות זו את זו

כאשר מציבים את שלוש הקריאות זו לצד זו, הסתירות לכאורה בספרות על מתילן כחול מתבהרות כהבדלים בשיטות בתוספת שלוש עובדות ביולוגיות.

ראשית, הצבע הוא גם מעביר אלקטרונים וגם מקור למי חמצן. באמצעות הסטת אלקטרונים מאתרי הנשימה שבהם חמצן היה הופך אחרת לסופראוקסיד, הוא יכול להפחית מין ROS אחד, בעוד צורתו המחוזרת מחזרת חמצן ישירות למי חמצן ומגבירה מין אחר. לכן מעבדה העוסקת בכימיית חמצון-חיזור במיטוכונדריה ובתפקידו של הצבע כמעקף צריכה לצפות לתשובות התלויות בגלאי: קריאה הרגישה לסופראוקסיד יורדת, בעוד קריאת מי חמצן עולה באותה קיווטה.

שנית, מי חמצן במינונים נמוכים הם אות, ולא רק גורם נזק. מחקר במיטוכונדריה ממוח עכבר, שנערך בעקבות העבודה המוקדמת, מצא יצירת מי חמצן כבר בריכוז צבע של חמישים ננומולר, ללא פגיעות ב-DNA המיטוכונדריאלי ברמות טיפוליות, עם הגנה מפני פגיעות שגורם רוטנון לאחר טיפול מקדים. רק בריכוז של מאה מיקרומולר, הרבה מעל הטווח הטיפולי, הצבע פגע במקטעי DNA מסוימים, ואור אדום יחד עם צבע בריכוז של עשרים מיקרומולר יצרו חמצן סינגלט שפגע בכל המקטעים שנבדקו. המנגנון המוצע הוא הורמטי: ייצור מתון של מי חמצן מפעיל מנגנוני הגנה נוגדי חמצון הקשורים ל-Nrf2 וביוגנזה של מיטוכונדריה, כך שקריאה מעודדת חמצון בטווח הקצר קודמת לתוצאה נוגדת חמצון בטווח הארוך. בדיקה שנקראת לאחר שעה ובדיקה שנקראת לאחר יום עשויות להניב תוצאות שונות משום שהביולוגיה השתנתה ביניהן.

שלישית, האור קובע איזו מולקולה בכלל נמצאת במערכת. תאורה גורמת להסרת קבוצות מתיל מהצבע ולהיווצרות Azure B ותוצרים קשורים, ודי במנורת המיקרוסקופ מעל צלחת כדי לעורר את פעילותו הפוטוסנסיטיבית. ניסויים בחושך וניסויים תחת תאורה הם ניסויים שונים, ופרק הבקרות לתאורה ולטיפול בצבע בכל פרוטוקול צריך להתייחס אליהם בהתאם.

מערך בקרות מינימלי, וכיצד לקרוא כל טענה

ההשוואה שלהלן היא חומר העזר המקורי של מאמר זה. לפני שמקבלים תוצאת ROS כלשהי בניסוי במתילן כחול, יש לבדוק איזו שורה המחברים יישמו ועל איזו דילגו.

מכאן נגזר כלל קריאה מעשי. Amplex עם פראוקסידאז, לאחר כיול ועם בדיקת קטלאז, מספק ראיות לגבי מי חמצן. DCFDA מספק ראיות לגבי חמצון לא ספציפי של הגלאי, ולא מעבר לכך. לכידת ספין עם בקרות של לוכדי רדיקלים מספקת ראיות לגבי זהות הרדיקל. צריכת חמצן מספקת ראיות לגבי השטף. משפט שטוען יותר מכפי שהבדיקה שלו יכולה לתמוך בו, גם אם הוא מנוסח בביטחון רב, הוא משפט על הגלאי ולא על הצבע. דיונים קשורים בתלות במינון ובטווח ההורמטי, בזרימת אלקטרונים במיטוכונדריה, בהפרעות לבדיקות בדגימות צבועות ובארטיפקטים של תאורה במיקרוסקופיה מרחיבים כל אחת מהנקודות האלה, וכל אחת מהן נותרת תקפה לאחר החלפת ההפניה הזמנית שלה.