הסבר על צבעי המתילן הכחול הבסיסי של לפלר והמתילן הכחול הפוליכרומי

שלושה בקבוקים עשויים לעמוד זה לצד זה על שולחן הצביעה, ועל כל אחד תווית של גרסה כלשהי של מתילן כחול. על אחד כתוב מתילן כחול מימי 1%. על אחר כתוב מתילן כחול בסיסי של לפלר. על השלישי כתוב מתילן כחול פוליכרומי. עובד עסוק מושיט יד לבקבוק הקרוב ביותר. המשטח נצבע אז חלש מדי, או בכחול אחיד מדי, או בגוונים סגולים בלתי צפויים, והדגימה היא זו שמואשמת בתוצאה.

זו בעיה של פורמולציה, לא של דגימה. שלוש התמיסות מכילות צבעים קרובים מבחינה כימית, אך מייצגות תפיסות צביעה שונות. אחת היא צבע קטיוני פשוט ב-pH קרוב לניטרלי. השנייה היא אותו צבע, שפעולתו הוגברה באמצעות בסיס. השלישית כבר אינה צבע יחיד כלל, אלא תערובת שחומצנה במכוון. שימוש בתמיסה הלא נכונה משנה את עקרון הצביעה תוך כדי העבודה.

התשובה הקצרה

מתילן כחול מימי רגיל הוא נקודת הבסיס: כ-1% צבע במים, צבע קטיוני פשוט לבחינת מורפולוגיה של חיידקים ולמיקרוסקופיה כללית. במתילן כחול בסיסי של לפלר מוסיפים כמות קטנה ומדודה של בסיס מדולל לתמיסת אם אלכוהולית שדוללה במים. כך עולה ה-pH ומתחזקת קשירת הצבע הקטיוני למבנים חומציים בחיידקים. מתילן כחול פוליכרומי הוא מתילן כחול שעבר הבשלה מכוונת באמצעות חמצון בסביבה בסיסית, ולכן הבקבוק מכיל תערובת של הומולוגים שעברו דה-מתילציה (azure A, azure B, azure C), תיונין וסגול מתילן, לצד מתילן כחול שיורי. תערובת זו צובעת מבנים שונים בגוונים שונים.

אם זוכרים רק משפט אחד: הבססה משנה את עוצמת הצביעה, ואילו הפיכה לפוליכרומי משנה את צבעי הצביעה.

מתילן כחול מימי רגיל: נקודת הייחוס

הפורמולציה הפשוטה ביותר היא מתילן כחול מומס במים, לרוב בריכוז 1% w/v, ללא בסיס וללא חמצון. הצורון הצבעוני הוא קטיון המתילתיוניניום עם יון כלוריד נגדי, צבע פנוטיאזיני קטן ושטוח המתואר ברשומת המתילן הכחול של PubChem כמתילתיוניניום כלוריד. כקטיון, הוא נקשר לשלדי הפוספט של חומצות גרעין ולקבוצות חומציות בדופנות תאי חיידקים, וצובע את התאים בכחול על רקע בהיר.

יתרונו הוא התנהגות צפויה. גרעינים וחיידקים נראים כחולים. הניגודיות מתונה. אורגניזמים שקשה להבחין בהם עשויים להיצבע בעוצמה חלשה, וזו בדיוק המגבלה שלפלר ביקש לתקן. להיכרות עם המשפחה הרחבה יותר של צבעים פשוטים לחיידקים שאליה משתייכת תמיסה זו, ראו סקירה של צביעה פשוטה של חיידקים. גם כאן חשוב להקפיד על זיהוי מדויק: מתיל כחול הוא מולקולה שונה לחלוטין, כפי שמוסבר במתיל כחול לעומת מתילן כחול, ולכן חיפוש בקטלוג לפי שם הצבע בלבד עלול להוביל למשפחת צבעים שגויה.

מתילן כחול בסיסי של לפלר: אותו צבע, פעולה מוגברת

המתכון הקלאסי של לפלר משלב תמיסת אם אלכוהולית של מתילן כחול עם בסיס מדולל במים. הגרסאות שבספרי הלימוד מציינות 0.3 g צבע ב-30 mL אתנול 95%, בתוספת 100 mL תמיסה מימית של אשלגן הידרוקסיד בריכוז 0.01% (או לחלופין 30 mL תמיסה אלכוהולית רוויה של מתילן כחול, 100 mL מים מזוקקים ו-1 mL של KOH בריכוז 1%). כך מתקבלת תמיסת עבודה עם כ-0.3% צבע ב-pH בסיסי במובהק. הגרסאות המסחריות פועלות לפי אותו עיקרון, וקטלוג צבעי המיקרוביולוגיה של Thermo Fisher מציג מתילן כחול בסיסי של לפלר לצד גרסאות פוליכרומיות ומימיות כפריטי קטלוג נפרדים בעלי שימושים מיועדים נפרדים.

הבסיס הוא לב הרעיון. העלאת ה-pH מסירה פרוטונים מקבוצות קרבוקסיל ופוספט בדגימה ומגדילה את צפיפות האתרים השליליים, ואילו תמיסת האם באתנול שומרת על הצבע מומס לחלוטין, כך שהוא מגיע לאתרים אלה בצורת מונומרים. התוצאה היא צביעה מהירה ועזה יותר של חיידקים מאשר בצבע מימי ניטרלי, עם המקלות והנקדים בכחול העמוק המוכר ממשטח בקטריולוגי שגרתי. זמן הצביעה הוא בדרך כלל דקה אחת עד שלוש דקות, ולאחר מכן מבצעים שטיפה במים.

היישום הקלאסי הוא Corynebacterium diphtheriae שגודל על מצע הסרום של לפלר: חיידקים מקלוניים דקים, לעיתים קרובות דמויי אלה, עם גרנולות מטכרומטיות על שם באבס-ארנסט, המכילות פוליפוספט מאוחסן ונצבעות בעוצמה רבה. השילוב בין המצע לצבע הוא היסטורי, ושניהם מיוחסים לאותו בקטריולוג; הניגודיות של הגרנולות היא היתרון האבחוני. מעבר לעבודה עם דיפתריה, הצבע משמש כצבע בקטריולוגי כללי למשטחים מתרביות, לבחינת המורפולוגיה של Neisseria במשטחים קליניים, ובכל מצב שבו אין צורך בצביעת גראם אך הכחול המימי הרגיל חלש מדי. זהו צבע מונוכרומי. כל מבנה חומצי מקבל גוון כלשהו של כחול. כאשר פרוטוקול דורש הבחנה באמצעות צבעים שונים, בסיס לבדו אינו יכול לספק אותה.

אזהרה מעשית אחת: תמיסות צבע בסיסיות מתדרדרות ונוצרים בהן משקעים במהלך האחסון ועם קליטת פחמן דו-חמצני. מעבדות מכינות כמויות קטנות יחסית או קונות את התמיסה הקטלוגית ומקפידות על חיי המדף שלה, במקום להמשיך להשתמש בבקבוק ישן שכעת מותיר משקעים על כל זכוכית נושא.

מתילן כחול פוליכרומי: שם אחד, כמה צבעים

מתילן כחול פוליכרומי מתחיל מאותו צבע, אך עובר חמצון מבוקר בסביבה בסיסית, תהליך שכונה בעבר הבשלה או הפיכה לפוליכרומי. יישון בסביבה בסיסית, חימום עם קרבונט או חמצון באמצעות חומרים כגון דיכרומט מסירים בהדרגה קבוצות מתיל מהמתמירים הדימתילאמיניים. התוצר הוא תערובת: מתילן כחול שיורי לצד azure B (לאחר אובדן קבוצת מתיל אחת), azure A ו-azure C (לאחר דה-מתילציה נוספת), תיונין (לאחר דה-מתילציה מלאה) ותוצרי לוואי של חמצון ממשפחת סגול המתילן. לכל רכיב גוון משלו וזיקה משלו לרקמות, ולכן התערובת צובעת באופן מטכרומטי: גרעינים, גרנולות, מוצינים וסחוס מקבלים כל אחד גוונים נבדלים, מכחול ועד אדום-סגול.

זו אותה כימיה העומדת מאחורי צבעי הדם המפורסמים. חוקרים בראשית הדרך גילו שמתילן כחול שעבר הבססה צובע את גרעיני טפילי המלריה בגוונים סגולים, אך התמיסות המימיות שהבשילו לא היו יציבות ונוצרו בהן משקעים בתוך ימים. הסקירה על המצאת צבע הדם הסגול מתארת כיצד מלאכובסקי ורומנובסקי ניצלו את האפקט הזה באופן בלתי תלוי ב-1891, כיצד הוכנס מתנול לשימוש כדי לייצב את משקע הצבע ולקבע משטחים ללא חימום, וכיצד גימזה תקנן בהמשך את התערובת סביב כמויות מדודות של azure B ואאוזין, עם ייצוב בגליצרול. צבעים מודרניים מסוג גימזה הם צאצאים ישירים של מתילן כחול פוליכרומי בתוספת אאוזין, השילוב שיוצר את אפקט רומנובסקי. לפרטים על השילוב עם אאוזין ועל רכיב ה-azure B, ראו צבעים מסוג רומנובסקי והאינטראקציה בין azure B לאאוזין.

מכיוון שמדובר בתערובת, מתילן כחול פוליכרומי הוא מטבעו הפחות מתוקנן מבין השלושה. האיזון המדויק בין גווניו תלוי במסלול החמצון ובמידתו, ולכן ספקי חומרים להיסטולוגיה מוכרים אותו כמוצר נפרד עם בדיקות ביצועים משלו, ולא כמתילן כחול של לפלר שהתיישן. שימושים טיפוסיים כוללים הדגמה מטכרומטית של גרנולות בתאי פיטום, מוצינים וסחוס, הצגת פרטים בתאי פלזמה והדגמת Helicobacter pylori בחתכי רקמה בשיטות פוליכרומיות מסוג גודפסצ'ר. זו הבחירה הנכונה כאשר המטרה היא הבחנה באמצעות צבע, והבחירה הלא נכונה כאשר הפרוטוקול מצפה לקווי מתאר ברורים ומונוכרומיים של חיידקים.

השוואת הפורמולציות והייעוד

קראו את הטבלה ככלי לקבלת החלטות. אם הדגימה נצבעת חלש מדי, שנו את הגישה ל-pH ובחרו בצבע של לפלר. אם הכול נצבע אך שום דבר אינו מובחן מהאחר, שנו את תפיסת הצבע ובחרו בפוליכרומי. אם משטח שנצבע בצבע של לפלר מציג גרנולות היטב, אך הממונה שואל מדוע הגרעינים והציטופלזמה חולקים אותו כחול, התשובה היא ששום צבע מונוכרומי בסיסי אינו יכול לבצע את המשימה הזו. שאלה זו שייכת למשפחה הפוליכרומית ולנגזרותיה לצביעת דם.

הימנעות מהבלבולים הנפוצים

שתי טעויות אחראיות לרוב הבלבול. הראשונה היא התייחסות לצבע של לפלר ולמתילן כחול רגיל כתחליפים זה לזה, משום ששניהם נראים כחולים בבקבוק. הם נבדלים ב-pH ובעוצמה, והחלפה בצבע ניטרלי במקום שבו נדרש הצבע של לפלר מאבדת בדיוק את ניגודיות הגרנולות שסביבה נכתב הפרוטוקול. השנייה היא התייחסות לכל צבע כחול בסיסי ישן או כזה שהתיישן במקרה כאל צבע פוליכרומי. יישון לא מבוקר יוצר תערובת לא ידועה בעוצמה לא ידועה, ואילו תמיסות פוליכרומיות אמיתיות מוכנות במסלולי חמצון מוגדרים, ובענף של צבעי הדם משולבות עם כמות מדודה של אאוזין. ההיסטוריה מלמדת כאן לקח: התמיסות המימיות המובשלות והבלתי יציבות של שנות ה-1890 פינו את מקומן לפורמולציות מתנוליות מיוצבות, בדיוק מפני שלא ניתן היה לשחזר תערובות לא מבוקרות. כדאי לזכור זאת לפני צביעת זכוכית נושא אבחונית מבקבוק שגילו אינו ידוע בוודאות.

הקפדה על שמות משלימה את התמונה. ודאו לפי התווית מהו פריט הקטלוג (מימי, לפלר או פוליכרומי), מהי תכולת הצבע ומהו היישום המיועד, במקום להסיק זאת מהצבע עצמו. לשלוש הפורמולציות מקור כרומופורי משותף. אין להן ייעוד משותף.