Tinción simple con azul de metileno fronte á tinción de Gram: que pode demostrar cada método

Un estudante prepara un frotis a partir dun cultivo etiquetado como E. coli, cóbreo con azul de metileno durante un minuto, enxáugao e obsérvao co obxectivo de inmersión en aceite. Uns bacilos azuis cobren o campo. O informe de laboratorio di: "Bacilos gramnegativos identificados como E. coli." A observación é correcta. A conclusión non está xustificada por esa preparación.

O erro é conceptual, non técnico. O estudante tratou unha tinción simple coma se fose unha proba diferencial. Unha tinción simple e unha tinción de Gram responden a preguntas distintas porque se basean en conceptos de tinción diferentes. Unha pregunta: que forma está presente. A outra pregunta: como se comporta a parede celular ao sometela a unha proba. Se se confunden as dúas, unha preparación correctamente tinguida dá lugar a un informe inxustificado.

Esta comparación mantén separados os dous métodos, mostra que permite afirmar cada resultado e responde ás dúas preguntas máis frecuentes dos estudantes: pódese usar o azul de metileno na tinción de Gram e que mostra realmente unha tinción de E. coli con azul de metileno.

A resposta breve

A tinción simple con azul de metileno tingue do mesmo azul todas as células que poden tinguirse, polo que revela a morfoloxía (bacilos, esferas, espirais) e a disposición (illadas, en pares, en cadeas), pero non indica nada sobre a categoría de Gram. A tinción de Gram engade iodo, un paso de descoloración e unha contratinción, polo que separa as bacterias en grampositivas (violetas) e gramnegativas (rosas ou vermellas) segundo como as súas envolturas reteñan o colorante. Uns bacilos azuis tras aplicar azul de metileno significan "hai células con forma de bacilo". Uns bacilos rosas tras unha secuencia completa de Gram significan "hai bacilos gramnegativos". A segunda afirmación é máis sólida porque o procedemento realizou unha proba adicional.

Para coñecer a familia máis ampla de métodos bacterianos cun único colorante á que pertence este artigo, consulta o atlas de tincións para microscopía.

Tinción simple: un colorante, unha pregunta

O azul de metileno é un colorante básico (catiónico). O seu ión coloreado ten carga positiva e únese a estruturas da célula con carga negativa, incluídos os ácidos nucleicos e os grupos ácidos da superficie, polo que as células aparecen azuis sobre un fondo claro. OpenStax describe este principio de tinción positiva no seu capítulo sobre tinción. O propio catión do colorante é o pequeno ión plano de fenotiazina descrito en detalle na referencia sobre a química do azul de metileno; o contraión cloruro non é o que dá a cor.

Un protocolo docente estándar é deliberadamente sinxelo: preparar un frotis fino, deixalo secar ao aire, fixalo con calor, cubrilo cunha solución acuosa de azul de metileno de aproximadamente o 1% durante arredor dun minuto, enxaugar suavemente con auga, secar por absorción e examinar con inmersión en aceite. Un protocolo docente de LibreTexts ofrece exactamente esta versión ao 1% durante un minuto, aínda que sinala que algúns laboratorios prolongan o tempo. Sen mordente, sen descolorante, sen un segundo colorante. Esa ausencia é precisamente a clave. Cun único colorante e sen eliminación selectiva, todas as células que se unen ao colorante acaban da mesma cor.

Con E. coli, o campo esperado é de bacilos azuis, illados, en pares ou en pequenos grupos. O azul procede do colorante. A forma de bacilo procede do organismo. Pero esa combinación non identifica o organismo, porque moitas especies teñen forma de bacilo e moitos bacilos tínguense de azul cunha tinción simple. ATCC explicita este límite á morfoloxía na súa guía de cultivos de microbioloxía. Un informe correcto di: "obsérvanse bacilos azuis". Calquera afirmación que vaia máis alá da forma e da disposición necesita máis probas.

Tinción de Gram: catro reactivos, unha proba de comportamento

A tinción de Gram é unha tinción diferencial. Somete todas as células á mesma secuencia e observa cales conservan o primeiro colorante e cales o perden. Os protocolos de tinción de Gram da American Society for Microbiology definen a orde estándar de catro pasos: violeta de cristal (colorante primario), iodo de Gram (mordente), alcohol ou alcohol-acetona (descolorante) e, despois, safranina (colorante de contraste).

O modelo docente estándar explica esta separación pola estrutura da envoltura. As células grampositivas teñen unha parede grosa de peptidoglicano que se deshidrata e retén o complexo de violeta de cristal e iodo durante o lavado con alcohol. As células gramnegativas teñen unha capa fina de peptidoglicano e unha membrana externa rica en lípidos que o descolorante altera, polo que o complexo se elimina co lavado e as células incorporan despois a safranina. A revisión da tinción de Gram de NCBI Bookshelf ofrece esta explicación baseada na parede celular. Os especialistas engaden que a fisicoquímica completa é máis complexa que o simple grosor da parede, pero para a interpretación no laboratorio a regra de comportamento segue sendo válida: violeta significa retención; rosa significa perda seguida de contratinción.

Paneis ilustrativos. Debuxos estilizados para comparar métodos, non micrografías tomadas cunha cámara. As cores simplifícanse para ensinar a lóxica: unha cor nunha tinción simple, dúas cores tras a descoloración de Gram.

Pódese usar o azul de metileno na tinción de Gram

Esta pregunta ten dúas interpretacións que precisan respostas diferentes.

Primeira interpretación: pode unha única aplicación de azul de metileno substituír toda a secuencia de Gram. Non. Sen iodo, descolorante e colorante de contraste non hai ningún paso diferencial, polo que non se pon a proba ningunha categoría de Gram. Un campo azul tras aplicar só azul de metileno é un resultado de tinción simple, aínda que o frasco estea xunto aos reactivos de Gram. Non o rexistres como un resultado de Gram.

Segunda interpretación: pode o azul de metileno substituír a safranina como colorante de contraste no paso 4. Funcionalmente pode tinguir as células descoloradas, e un exercicio de libro de texto prevé células grampositivas violetas e células gramnegativas azuis tras esa substitución. A lóxica é sólida porque as células gramnegativas correctamente descoloradas son case incoloras e incorporarán outro colorante catiónico. Pero non é o protocolo estándar. Os protocolos de ASM especifican safranina, con alternativas recoñecidas como a fucsina básica nalgunhas variantes, non azul de metileno. Tamén hai un inconveniente práctico: é máis difícil distinguir o azul do violeta que o rosa do violeta, especialmente para principiantes e, sobre todo, con lámpadas de microscopio desgastadas. Para as prácticas académicas e calquera resultado que importe, usa o colorante de contraste indicado no teu protocolo, normalmente safranina, e trata a contratinción con azul de metileno como unha variante de demostración, non como un estándar equivalente.

A pregunta relacionada sobre como se compara o azul de metileno con outras opcións dun único colorante trátase nunha comparación de tincións bacterianas simples.

Que demostra a tinción de E. coli con azul de metileno e que non

E. coli é un bacilo gramnegativo, pero esa frase combina datos de varios métodos: a morfoloxía procede da microscopía; a reacción de Gram, dunha tinción de Gram; e a identidade, do cultivo xunto con probas bioquímicas ou moleculares. Un frotis con azul de metileno achega só a primeira parte. Establece que na mostra tinguida hai células con forma de bacilo e como están dispostas. Non establece a reacción de Gram, porque non se realizou ningunha proba de descoloración. Non identifica a especie, porque os bacilos de moitas especies teñen un aspecto semellante a esta resolución.

É aquí onde os informes fallan dun xeito previsible. Quen os redacta incorpora coñecementos previos ("suponse que este cultivo é de E. coli, e E. coli é gramnegativa") á liña da observación, polo que a preparación parece confirmar o que en realidade se deu por suposto. Un informe máis claro separa os niveis: "Tinción simple con azul de metileno: obsérvanse bacilos azuis; só morfoloxía, non se probou ningunha categoría de Gram." Despois, se se realizou correctamente unha tinción de Gram con controis: "Tinción de Gram: bacilos rosas, compatibles cunha reacción gramnegativa." A identidade da especie obtense máis adiante, mediante o procedemento de identificación, non só pola cor.

Unha guía práctica de interpretación

Usa esta regra de decisión no laboratorio. Se todas as células teñen unha soa cor e o protocolo empregou un único colorante sen descolorante, realizaches unha tinción simple. Informa da forma, da estimación do tamaño e da disposición. Non vaias máis alá. Se o protocolo empregou violeta de cristal, iodo, descolorante e colorante de contraste con controis positivos e negativos coñecidos, realizaches unha tinción de Gram. Informa da cor e da morfoloxía: cocos violetas en cadeas, bacilos rosas, etc.

Tres erros explican a maior parte da confusión. Primeiro, interpretar os bacilos azuis como unha confirmación de E. coli. Segundo, rexistrar unha preparación con azul de metileno baixo o encabezado "Tinción de Gram" nun caderno, o que fará que lectores posteriores a interpreten mal. Terceiro, cambiar os colorantes de contraste sen criterio e comparar despois as cores entre laboratorios coma se as paletas coincidisen. Cada erro ten a mesma solución: nomea o método que realmente se realizou e afirma só o que ese método pon a proba.

A tinción simple ten o seu lugar precisamente porque permite afirmar pouco. É rápida, tolera pequenas desviacións e abonda cando a pregunta é sobre a morfoloxía: hai algo e que forma ten. Cando a pregunta é sobre a clasificación, realiza a proba diferencial. A preparación azul indica que aspecto teñen as células. A preparación violeta ou rosa indica como se comportan as súas paredes. Ningunha das dúas, por si soa, indica a especie.