Tinción de células da meixela con azul de metileno: que observar

Unha alumna coloca unha gota dunha suspensión de células da meixela nun portaobxectos, mira polo microscopio e case non ve nada. Unhas poucas sombras pálidas desprázanse por un campo luminoso. Axusta o enfoque, aumenta a luz e acaba concluíndo que o portaobxectos está baleiro. Pero non está baleiro. As células están aí. Son case transparentes, e a transparencia é precisamente o problema que esta tinción pretende resolver.

Paga a pena sinalar esa diferenza entre a expectativa e a imaxe antes de comezar o protocolo. Quen se inicia espera que un microscopio revele detalles do mesmo xeito que o zoom dunha cámara permite ler un cartel distante. Un microscopio de campo claro fai algo máis limitado: mostra diferenzas na absorción da luz. Unha célula da meixela sen tinguir case non absorbe luz, polo que apenas introduce diferenzas. O azul de metileno engade esa diferenza. Únese de maneira desigual no interior da célula e converte a estrutura en contraste. Unha vez que o alumnado comprende este concepto, cada paso posterior enténdese como unha consecuencia, non como unha receita.

Aquí resulta útil coñecer como as tincións simples engaden contraste no laboratorio escolar, e repasar a posta a punto dun microscopio de campo claro antes da tinción evita a metade das preparacións fallidas. A química que explica a cor trátase nunha introdución ao azul de metileno en microscopía, que explica por que este colorante concreto aparece con tanta frecuencia na bancada.

O protocolo de aula

A versión de montaxe en fresco que se presenta a continuación é a opción máis sinxela para as clases xerais. Non require chama nin ningún paso de fixación. A variante con frotis fixado que empregan algúns manuais universitarios engade secado ao aire e unha breve fixación por calor, como na actividade de frotis da meixela do North Central Texas College publicada en Biology LibreTexts, pero a fixación por calor é unha práctica habitual en microbioloxía, non un requisito para ver células epiteliais.

Material necesario: portaobxectos e cubreobxectos limpos, hisopos estériles dun só uso (preferibles) ou escarvadentes planos novos, un frasco contagotas con azul de metileno acuoso ao 0.5 a 1 por cento, auga destilada ou desionizada, papel absorbente, luvas e un microscopio composto cun aumento total de 100x e 400x.

1. Enxaugar a boca con auga soa. Isto elimina partículas de alimentos que despois se tinguen intensamente e distraen a atención das células.
2. Cada estudante toma unha mostra unicamente da súa propia meixela. Fregar suavemente o interior da meixela cun hisopo estéril novo. Presionar, non raspar. Deterse moito antes de que apareza calquera molestia ou sangrado.
3. Facer rodar o hisopo polo centro dun portaobxectos limpo para deixar unha capa fina. Unha película fina é o factor que mellor predí unha preparación fácil de interpretar. Un depósito branco groso tinguirase ata formar unha masa azul imposible de interpretar.
4. Engadir unha gota de azul de metileno sobre o frotis. Deixar actuar de 1 a 3 minutos. Un minuto abonda en moitos protocolos universitarios; o manual de laboratorio de ciencias de clase IX do NCERT emprega uns 3 minutos para unha montaxe temporal. Máis tempo non é mellor, e a tinción excesiva é o erro de tempo máis habitual.
5. Enxaugar suavemente con auga destilada ou retirar o exceso de colorante por capilaridade con papel absorbente, seguindo o protocolo local. O fondo debe quedar azul pálido, non azul mariño intenso.
6. Baixar o cubreobxectos inclinado para que un bordo toque primeiro e despois deixalo caer lentamente. Isto evita as burbullas de aire.
7. Comezar cun aumento baixo para localizar as células, comprobar o enfoque e o centrado, e despois pasar a 100x e finalmente a 400x. A 400x empregar só o axuste fino do enfoque.

A concentración do colorante merece unha frase precisa. Os protocolos escolares adoitan empregar azul de metileno acuoso arredor do 1 por cento. Unha solución de partida máis concentrada ou unha exposición prolongada escurece o fondo máis rápido ca o núcleo, o que inverte o contraste do que depende o exercicio.

Manipulación segura do material da meixela

As mostras da meixela conteñen saliva e microorganismos normais da boca, polo que cada frotis fresco debe tratarse como material potencialmente infeccioso, aínda que os doantes sexan compañeiros sans. As directrices de bioseguridade da American Society for Microbiology para laboratorios docentes establecen os principios xerais: avaliar o risco antes da sesión, levar luvas, protexer os ollos cando poida haber salpicaduras, lavar as mans ao rematar, desinfectar as bancadas e eliminar o material desbotable contaminado pola vía autorizada para residuos biolóxicos.

Catro normas de aula cobren a maior parte do risco. Un doante por hisopo e por portaobxectos, sen compartilos nunca. Só se permite tomar mostras propias, nunca dun compañeiro. Os hisopos e escarvadentes dun só uso van directamente ao recipiente de residuos designado, nunca de volta á bancada. O propio azul de metileno mancha a pel e a roupa e irrita os ollos, polo que se deben usar luvas e aplicar as medidas habituais de hixiene para colorantes. Non ampliar este exercicio cultivando nada procedente do frotis nin improvisar a fixación por calor de material humano fresco fóra do procedemento de seguridade do centro.

Que observar e por que ten ese aspecto

A 100x, buscar células anchas e planas, de cor azul pálida, con contornos ovalados irregulares ou poligonais. Aparecen illadas ou en láminas pouco compactas que se superpoñen. Cada célula adoita presentar un punto azul máis escuro. Ese punto é o núcleo. Observar tamén a disposición: as células epiteliais escamosas son como baldosas finas, non esferas, por iso os seus bordos semellan un esmalte gretado en vez de globos redondos.

A 400x distínguense con claridade tres características. O límite celular aparece como unha liña fina máis escura que rodea a célula. O citoplasma enche o interior cun azul claro uniforme. O núcleo é máis escuro e compacto, a miúdo ovalado e normalmente próximo ao centro, aínda que non sempre. Pedir ao alumnado que rexistre os tres elementos, ademais da forma e do aumento, porque a ficha solicita exactamente iso.

Aquí importa unha precisión que moitas fichas presentan de maneira incorrecta. O límite visible corresponde á rexión da membrana plasmática, pero a propia membrana, unha bicapa lipídica duns 7 a 10 nanómetros de grosor, está moi por debaixo do que pode resolver un microscopio escolar. O que ve o alumnado é o bordo óptico da célula xunto co colorante acumulado alí. A mesma cautela aplícase aos orgánulos. As mitocondrias, o retículo endoplasmático, os corpos de Golgi e os ribosomas non se ven nesta preparación. Un microscopio óptico convencional pode resolver detalles de ata aproximadamente 0.2 micrómetros en boas condicións, como explica a introdución do NCBI ás ferramentas de microscopía en bioloxía celular, e a maior parte da ultraestrutura sitúase por debaixo dese límite ou preto del. Un aumento baleiro maior fai a imaxe máis grande sen engadir detalles.

Por que se tingue o núcleo cunha cor máis escura? O azul de metileno é un colorante catiónico, con carga positiva en solución, e asóciase co material de carga negativa da célula, sobre todo cos ácidos nucleicos. A cromatina concentra o ADN no núcleo, polo que este acumula máis colorante. O citoplasma contén ARN e outras moléculas con carga, así que tamén se tingue, pero de maneira máis difusa e máis clara. A precisión fundamental: o azul de metileno non é un colorante específico para o ADN. Os estudos sobre a distribución do azul de metileno na obtención de imaxes do núcleo describen a asociación do catión con rexións ricas en ácidos nucleicos, e un traballo cuantitativo anterior sobre a unión do azul de metileno en preparacións celulares atopou que a maior parte do colorante unido estaba asociada aos ácidos nucleicos. Polo tanto, un núcleo escuro e un citoplasma claro constitúen un patrón de contraste, non unha análise molecular.

Erros que cometerá o alumnado e como interpretalos

Case todas as preparacións fallidas encaixan nun de cinco patróns. Ensinar ao alumnado a diagnosticar o problema da preparación en vez de repetila ás cegas.

A tinción excesiva escurece uniformemente as células e o fondo, de modo que o núcleo deixa de distinguirse no campo. Corrixila cun tempo de tinción máis curto ou cun enxaugado máis completo. A tinción insuficiente deixa sombras que desaparecen ao aumentar a luz; aumentar o tempo en intervalos de trinta segundos. Os frotis grosos producen masas densas e superpostas nas que non se pode seguir ningún contorno; a corrección é mecánica: estender unha capa máis fina a próxima vez, xa que ningún enxaugado salva unha morea de células. As burbullas de aire aparecen como círculos perfectos con bordos escuros ben definidos e distraen a quen se inicia, que as confunde con estruturas; volver colocar o cubreobxectos lentamente e inclinado. Os pequenos puntos escuros dispersos sobre as células ou arredor delas adoitan ser bacterias normais da boca, como sinalan protocolos escolares como o procedemento de células da meixela de Ingrid Science. Confirman que a boca está habitada, algo que pode resultar memorable para o alumnado, pero neste exercicio non se pode identificar a especie e non se deben debuxar como partes da célula. Os restos de alimentos e os filamentos de moco tínguense de maneira irregular e intensa; o enxaugado previo serve para reducilos.

O que este exercicio non pode facer

Trátase dunha observación educativa, non dunha proba diagnóstica. Nada no aspecto das células nunha tinción de aula permite diagnosticar infeccións, cancro ou ningunha enfermidade, e o artigo non debe interpretarse como unha suxestión do contrario. A preparación mostra a forma, o límite, o citoplasma e o núcleo a dous aumentos. Non mostra a ultraestrutura da membrana, os detalles dos orgánulos nin a identidade molecular. Expresar este límite de maneira explícita protexe tanto a ciencia como o alumnado: un bo resultado é un debuxo correctamente rotulado co aumento e a tinción rexistrados, non unha conclusión sobre a saúde.

Ficha para o alumnado e micrografías rotuladas

Os dous recursos do proxecto para esta páxina son a micrografía rotulada anterior e a ficha seguinte. Imprimir unha ficha por estudante ou proxectala e pedir ao alumnado que copie os recadros nos cadernos.

Como utilizala nunha sesión de 45 minutos: dez minutos para as instrucións de seguridade e a toma de mostras, dez minutos para a tinción e a montaxe, quince minutos para a observación e os debuxos a ambos os aumentos, e dez minutos para a lista de comprobación e a comparación coa micrografía rotulada. Os elementos da lista de comprobación son deliberadamente mecánicos. Frotis fino, tempo de tinción correcto, núcleo máis escuro ca o citoplasma, aumento rexistrado. Un estudante que pode marcar os catro comprendeu o concepto que a lección pretende ensinar: os microscopios mostran diferenzas, e as tincións crean as diferenzas que paga a pena mostrar.