Por que se usa o azul de metileno como colorante de contraste na tinción de acidorresistencia

Un técnico examina un frotis de esputo tras completar a secuencia de tinción. Os bacilos vermellos destacan sobre un campo azul, e no informe indícase que se observaron bacilos acidorresistentes. Ao día seguinte, outro portaobxectos mostra un campo azul uniforme sen bacilos vermellos, e infórmase como negativo para tuberculose. Un destes informes afirma máis do que permite concluír o portaobxectos, e non é o primeiro.

A confusión é conceptual. O técnico considerou o colorante azul parte da química de detección, como se o azul de metileno axudase a localizar as micobacterias. Non o fixo. Cando o azul de metileno entra en contacto co portaobxectos, a proba xa rematou. O colorante só colorea o fondo para que o resultado se poida ler. Este artigo explica a función do azul de metileno na tinción de acidorresistencia, por que é azul e non doutra cor, e que permite concluír o vermello sobre azul.

A resposta breve

A tinción de acidorresistencia é unha proba diferencial baseada en tres ideas. A fucsina fenicada, o colorante primario, introdúcese á forza en todas as células, incluídas as micobacterias de envoltura cerosa. O ácido-alcohol, o descolorante, elimina o colorante vermello das células ordinarias, pero non consegue extraelo das acidorresistentes. O azul de metileno, o colorante de contraste, colorea despois todo aquilo do que o descolorante retirou o colorante, de xeito que as células non acidorresistentes, as células do hóspede e os restos aparecen azuis, mentres que os bacilos acidorresistentes permanecen vermellos. A contratinción proporciona contraste. Non intervén na química que fai que unha célula sexa acidorresistente.

Que fai cada paso

O diagrama seguinte mostra o reparto de funcións. Léeo de esquerda a dereita como un procedemento, e le a franxa inferior como recordatorio de que cada familia de tincións responde a unha pregunta diferente.

Primeiro vén a penetración. As micobacterias resisten os colorantes acuosos ordinarios porque a súa envoltura é especialmente hidrófoba, polo que o protocolo forza a entrada. No método de Ziehl-Neelsen, o quecemento ata producir vapor impulsa a fucsina fenicada, que contén fenol, a través da parede cerosa. No método en frío de Kinyoun, a calor substitúese por unha formulación do colorante primario moito máis concentrada, e algunhas versións modificadas sen calor engaden tensioactivos. Os protocolos de tinción de acidorresistencia da American Society for Microbiology documentan ambas as formulacións en paralelo, e a diferenza de concentración é notable: aproximadamente 0.3 g de fucsina básica por 100 mL no método con quecemento fronte a uns 4 g no método en frío.

En segundo lugar vén a diferenciación. O ácido-alcohol, habitualmente 3 mL de ácido clorhídrico concentrado en 97 mL de etanol ao 95 por cento, elimina o colorante vermello de todas as células cuxa parede non ofrece unha resistencia especial. As células coa envoltura lipídica micobacteriana intacta reteñen o colorante. Este é o paso do que depende todo o método, e o máis sensible á técnica, como se comenta máis adiante.

O contraste chega ao final. O portaobxectos contén agora células acidorresistentes vermellas sobre un fondo case incoloro de células que perderon o colorante. O azul de metileno ao 0.3 por cento w/v devolve a visibilidade a ese fondo cunha cor o máis afastada posible do vermello. A contratinción é breve, normalmente de 20 a 30 segundos no método con quecemento e ata uns poucos minutos nalgunhas variantes do método en frío; a duración depende do protocolo, non dunha propiedade do propio colorante.

Por que este colorante e por que azul

O azul de metileno é un colorante básico catiónico, o que significa que o seu ión coloreado ten carga positiva e se une ás superficies con carga negativa das bacterias descoloradas, das células do hóspede e dos restos. OpenStax Microbiology describe esta lóxica das cargas como o principio xeral dos colorantes básicos. Pero o azul de metileno non é quimicamente único neste contexto. O violeta de cristal e a safranina tamén son colorantes básicos. A elección é óptica, non química.

Os bacilos vermellos necesitan un fondo cun ton contrastante, e o azul oponse ao vermello da maneira máis útil para a microscopía de campo claro. A safranina sería un mal colorante de contraste porque a súa cor final rosa-vermella se aproxima demasiado á da fucsina fenicada retida, anulando a distinción que o procedemento creou. O violeta de cristal daría un fondo violeta escuro que competiría cos finos bacilos vermellos pola atención. A proba máis sólida de que a función é proporcionar contraste e non intervir na química é a substitución: os colorantes de contraste verdes, como o verde de malaquita e o verde brillante, úsanse nalgúns protocolos veterinarios e modificados, e a proba segue funcionando, porque calquera ton claramente diferente cumpre a mesma función.

Disto despréndense dúas consecuencias prácticas. Primeiro, a receita estándar non especifica ningún axuste de pH; non confundas esta solución acuosa simple ao 0.3 por cento con formulacións alcalinas como o azul de metileno de Loeffler, que pertencen a outro concepto de tinción. Segundo, o exceso prexudica. A bibliografía de histoloxía advirte expresamente de que un fondo azul demasiado intenso pode ocultar bacilos escasos, polo que manter o portaobxectos cuberto de colorante máis tempo do permitido polo protocolo reduce a lexibilidade sen achegar nada.

A química da parede que fai posible a proba

A razón pola que o ácido-alcohol diferencia as células está na envoltura micobacteriana. O seu núcleo estrutural é o complexo micolil-arabinogalactano-peptidoglicano: peptidoglicano unido a arabinogalactano cuxos extremos externos levan ácidos micólicos de cadea moi longa, formando unha micomembrana externa rica en lípidos e de permeabilidade excepcionalmente baixa. A revisión sobre a membrana externa micobacteriana detalla esta arquitectura. A barreira actúa en ambas as direccións. Resiste a entrada do colorante, polo que a penetración necesita calor ou un colorante primario máis concentrado, e resiste a extracción do colorante, polo que o ácido-alcohol non consegue eliminar a fucsina fenicada unha vez que está dentro. As bacterias ordinarias carecen desta envoltura e perden o colorante. Por tanto, a acidorresistencia enténdese mellor como un fenómeno de barreira lipídica, non como unha unión química da fucsina ao ácido micólico.

Esta química tamén explica unha incógnita habitual: as micobacterias tínguense mal e de forma imprevisible co método de Gram, e ás veces aparecen como formas tenues de aspecto arrosariado ou como siluetas sen tinguir. A súa parede hidrófoba limita a penetración do violeta de cristal. A tinción de acidorresistencia non é unha tinción de Gram modificada. É un principio diferencial distinto, baseado noutra propiedade da parede, como mostra a comparación entre a tinción simple e a tinción de Gram para os outros dous métodos.

Tres métodos, tres preguntas

Para coñecer a familia máis ampla de métodos bacterianos cun único colorante, consulta o atlas de tincións para microscopía.

Que non pode demostrar o vermello sobre azul

Os bacilos vermellos indican que os organismos retiveron a fucsina fenicada tras a exposición ao ácido-alcohol. Ese achado é compatible con Mycobacterium tuberculosis, pero as directrices dos CDC para o diagnóstico da tuberculose sinalan expresamente que outras micobacterias tamén son acidorresistentes, polo que a identificación da especie require cultivo e probas de ácidos nucleicos, non cor.

Os erros técnicos concéntranse nos dous lavados. Unha descoloración insuficiente deixa vermello o material de fondo e favorece lecturas falsas positivas. Unha descoloración excesiva elimina o colorante primario retido débilmente e contribúe aos falsos negativos. Unha contratinción demasiado intensa oculta en azul os bacilos escasos. Os frotis grosos, os reactivos precipitados e a auga de enxaugadura contaminada engaden os seus propios artefactos.

A sensibilidade está limitada pola cantidade de organismos, por moi depurada que sexa a técnica. A microscopía convencional de frotis necesita aproximadamente entre 5,000 e 10,000 bacilos por mililitro de esputo, e revisións anteriores da evidencia realizadas polos CDC situaban a sensibilidade do frotis arredor do 45 ao 80 por cento entre os casos pulmonares confirmados por cultivo. Por tanto, un frotis negativo nunca exclúe a tuberculose. As directrices actuais dos CDC manteñen o cultivo xunto con cada frotis e recomendan probas de amplificación de ácidos nucleicos en polo menos unha mostra respiratoria cando se considera a posibilidade de tuberculose pulmonar e o resultado cambiaría o manexo clínico.

O traballo práctico debe seguir protocolos autorizados

As descricións educativas, incluído este artigo, non autorizan o traballo clínico. Para a práctica no laboratorio, segue o procedemento normalizado de traballo validado do laboratorio, acorde cos documentos actuais dos CDC, APHL ou CLSI; a referencia dos CDC sobre tinción de acidorresistencia conservada no seu arquivo Stacks mostra como estes procedementos especifican os reactivos e a lectura dos resultados. O traballo con mostras de tuberculose require medidas de contención: os frotis prepáranse nunha cabina de seguridade biolóxica porque a preparación xera aerosois e salpicaduras, e as directrices de seguridade no laboratorio dos CDC indican que mesmo os frotis fixados con calor poden conter bacilos tuberculosos viables e deben seguir manipulándose como material contaminado. A entrada da Public Health Image Library dos CDC sobre un frotis tinguido con fucsina fenicada e azul de metileno examinado para detectar M. leprae é un recordatorio útil do alcance do método máis alá da tuberculose: o mesmo contraste de vermello sobre azul serve sempre que se buscan organismos acidorresistentes, e unha lectura negativa coidadosa é, en si mesma, un resultado que merece quedar rexistrado.

Lectura do portaobxectos rematado

A contratinción demostra a súa utilidade durante o exame inicial. Ao examinar con poucos aumentos, a persoa que realiza a microscopía utiliza primeiro o fondo azul para avaliar a calidade do frotis: distribución uniforme das células, células do hóspede intactas para enfocar e ausencia de precipitados abundantes. Os posibles bacilos vermellos atraen despois a mirada precisamente porque nada máis no portaobxectos é vermello. A confirmación faise con inmersión en aceite, onde os verdadeiros bacilos mostran os bastóns finos esperados, ás veces lixeiramente curvos ou de aspecto arrosariado, en lugar de restos uniformes de colorante.

A tinción do fondo tamén determina o vocabulario do informe. Nun portaobxectos con bacilos vermellos infórmase que se observaron bacilos acidorresistentes, a miúdo cun grao semicuantitativo segundo a escala do laboratorio. Nun portaobxectos sen organismos vermellos infórmase que non se observaron bacilos acidorresistentes, nunca que é negativo para tuberculose. A distinción importa porque o campo azul demostra que a tinción funcionou, que as células incorporaron o colorante de contraste e que as condicións ópticas eran adecuadas, pero non di nada sobre os organismos por debaixo do límite de detección. Un campo azul sen bacilos é un resultado válido sobre o portaobxectos, non un veredicto sobre o paciente.

Lembra o reparto de funcións e os informes redactaranse por si sós. A fucsina fenicada detecta candidatos. O ácido-alcohol realiza a proba. O azul de metileno só fai lexible a resposta: o vermello retivo o colorante fronte ao ácido; o azul perdeuno. Todo o demais, a especie, a carga de organismos e o significado clínico, procede do traballo que vai máis alá do portaobxectos.