Novo azul de metileno e tinción de reticulocitos: un colorante distinto e un método con células vivas

Un estudante prepara un reconto de reticulocitos, encarga azul de metileno, mestúrao con sangue e apenas ve nada. Un compañeiro usa un frasco etiquetado como novo azul de metileno e obtén filamentos azuis nítidos nunha parte dos glóbulos vermellos. O primeiro estudante supón que o segundo frasco é máis recente ou máis concentrado. Non é ningunha das dúas cousas. Contén unha molécula diferente.

Este é o erro conceptual que explica a maior parte da confusión neste ámbito. O nome suxire que o novo azul de metileno é un lote mellorado de azul de metileno. A química di o contrario. O novo azul de metileno N é un colorante de fenotiazina distinto, co seu propio número do Colour Index, o seu propio patrón de substitución e a súa propia función normalizada en hematoloxía. Unha vez aclarada esa diferenza, o resto do método (por que as células deben estar vivas ao tinguilas, que se considera un reticulocito, que papel teñen os corpos de Heinz e cando entra en xogo o azul de cresilo brillante) resulta sinxelo.

A resposta breve

O novo azul de metileno N, o reactivo hematolóxico, identifícase xeralmente como Basic Blue 24 na ficha de PubChem do novo azul de metileno, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, fórmula C18H22ClN3S. O azul de metileno común é cloruro de metiltioninio, Basic Blue 9, na súa ficha de PubChem, C.I. 52015, CAS 61-73-4, fórmula C16H18ClN3S. Estruturalmente, o novo azul de metileno leva dous grupos metilo no anel e cadeas laterais etilamino onde o azul de metileno leva grupos dimetilamino. Esa diferenza cambia o comportamento da tinción. Os textos de hematoloxía describen o azul de metileno común como un colorante relativamente pouco eficaz para reticulocitos e o novo azul de metileno como un colorante que produce unha tinción máis intensa e uniforme, unha comparación resumida no tema de ScienceDirect sobre o novo azul de metileno.

Si, o novo azul de metileno é un colorante supravital. A tinción supravital consiste en tinguir células vivas despois de extraelas do corpo e antes da fixación, segundo a definición da revisión do NCBI sobre os principios da tinción supravital. Tanto o novo azul de metileno como o azul de cresilo brillante pertencen a esta categoría, e a norma do CLSI para reticulocitos inclúe explicitamente o novo azul de metileno como colorante supravital. Ás veces, os estudantes clasifícano xunto coa tinción de Romanowsky de frotis fixados. Ese modelo mental non funciona aquí. Se se fixa primeiro, o método deixa de funcionar.

Para quen queira distinguir nomes de colorantes próximos, azul de metilo fronte a azul de metileno aborda unha confusión diferente e máis ampla entre un colorante aniónico de triarilmetano e a familia catiónica das fenotiazinas. A visión xeral da tinción de laboratorio sitúa o traballo supravital entre os métodos con frotis fixados, e a guía de morfoloxía das células sanguíneas mostra onde encaixa a avaliación dos reticulocitos no reconto diferencial máis amplo.

Unha advertencia sobre os catálogos: existe unha forma distinta de sal dobre con cloruro de cinc do novo azul de metileno co CAS 6586-05-6. Por iso, unha sección de métodos debe indicar a forma salina e o provedor, non só o nome común.

Que fai realmente a tinción supravital

Un reticulocito é un glóbulo vermello novo que perdeu o núcleo, pero conserva ARN ribosómico residual. Nunha preparación húmida sen tinguir, ese ARN é invisible. O colorante supravital entra na célula viva e precipita ou agrega ese ARN en gránulos e filamentos azuis, o material reticulofilamentoso que se observa con inmersión en aceite. A rede é, polo tanto, un produto da tinción, non un esqueleto preformado á espera de recibir cor. Por iso, as variables do protocolo (concentración do colorante, tampón, proporción entre sangue e colorante, temperatura e tempo) importan tanto como o nome do colorante.

A consecuencia práctica é unha orde estrita de operacións: primeiro mesturar o sangue anticoagulado co colorante, incubar e despois preparar os frotis e examinalos sen fixación nin contratinción. A fixación antes da tinción, ou unha contratinción que oculte os filamentos tenues, destrúe a información da que depende o reconto.

Un protocolo práctico para reticulocitos con novo azul de metileno

Non existe unha única formulación universal, así que cómpre indicar a utilizada. Tres variantes documentadas mostran a diversidade.

O procedemento clásico de tipo Brecher usa aproximadamente un 0.5 por cento de novo azul de metileno con oxalato de potasio, mesturado en volumes iguais con sangue con EDTA ben mesturado, e incubado durante uns 10 a 15 minutos a temperatura ambiente. Tras volver mesturar suavemente, prepáranse frotis finos en cuña, déixanse secar ao aire e examínanse sen fixar co obxectivo de inmersión en aceite de 100x. O procedemento do NCBI para o reconto de reticulocitos describe este fluxo de traballo e o marco de reconto que se utiliza.

A variante de Dacie e Lewis usa un 1.0 por cento de novo azul de metileno en solución salina con citrato, mesturado con 2 a 4 volumes de sangue e mantido a 37 C durante 15 a 20 minutos antes de preparar os frotis. Unha aplicación recente de harmonización do procedemento CLSI H44 empregou unha solución máis diluída, ao 0.1 por cento, en solución salina tamponada con fosfato a pH 7.4, con incubación a 20 C durante 10 minutos e sen fixación, segundo o estudo de harmonización de NMB de 2026.

As regras de reconto son comúns a todas as variantes. Clasifica unha célula como reticulocito cando conteña polo menos dous gránulos ou segmentos de filamentos diferenciados tinguidos de azul, o que exclúe os depósitos illados de colorante. Conta polo menos 1,000 glóbulos vermellos no traballo de rutina e informa dos reticulocitos como porcentaxe. Con porcentaxes baixas, a estatística esixe máis células. Unha revisión da metodoloxía CLSI H44 sinala que, preto do 1 por cento de reticulocitos, fan falta unhas 4,400 células para reducir a variación do reconto ao 5 por cento, na revisión de CLSI H44 en De Gruyter. Un disco ocular de Miller facilita os recontos grandes. Filtra o colorante ou prepárao de novo, porque o precipitado imita as inclusións granulares.

Corpos de Heinz na mesma preparación

O mesmo frotis supravital tamén pode mostrar corpos de Heinz, que son agregados de hemoglobina oxidada e desnaturalizada, non ARN residual. Nas preparacións con novo azul de metileno aparecen como corpos redondos, a miúdo únicos e próximos á membrana, tinguidos dun azul máis claro que o material reticulofilamentoso. Consérvanse mal tras a fixación e a contratinción, así que cómpre examinar o frotis sen fixar. Un protocolo recente que empregou 20 microlitros de sangue con EDTA con 20 microlitros de novo azul de metileno ao 1 por cento e 15 minutos de incubación cuantificou as células positivas para corpos de Heinz entre 250 eritrocitos, no estudo de PMC que describe ese procedemento.

Dúas distincións evitan interpretacións erróneas. Primeiro, o violeta de metilo e o violeta cristal tinguen os corpos de Heinz con máis intensidade que o novo azul de metileno, como se sinala no tema de ScienceDirect sobre os corpos de Heinz. O novo azul de metileno é a opción práctica cando se avalían xuntos os reticulocitos e os corpos de Heinz, non o colorante específico máis intenso para corpos de Heinz. Segundo, as inclusións de HbH no trazo de alfa talasemia producen numerosos puntos finos por toda a célula tras a tinción supravital, mentres que os corpos de Heinz clásicos son menos numerosos, máis grandes e adoitan estar asociados á membrana. Os depósitos de colorante son o terceiro elemento que pode confundirse con eles: sitúanse fóra do plano focal das células e varían entre campos.

Azul de cresilo brillante fronte a novo azul de metileno

Ambos os colorantes son supravitais e serven para tinguir reticulocitos, pero a normalización favorece un deles. O método para reticulocitos CLSI H44-A2, desenvolvido conxuntamente co Consello Internacional para a Normalización en Hematoloxía e incluído na páxina da norma CLSI H44, designa a tinción de sangue con EDTA mediante novo azul de metileno como método comparativo manual. O ensino clásico da hematoloxía coincide no aspecto: o novo azul de metileno produce unha tinción dos filamentos máis intensa e uniforme, mentres que o azul de cresilo brillante varía máis entre lotes e mostras.

Esa posición require un matiz. A guía do ICSH para a avaliación de analizadores acepta a microscopía manual con novo azul de metileno como método de comparación de referencia, pero cualifícaa de subxectiva e relativamente imprecisa, e prefire os procedementos de referencia por citometría de fluxo cando están dispoñibles. Unha comparación de 2022 con 100 mostras atopou un nesgo menor respecto ao seu analizador co azul de cresilo brillante que co novo azul de metileno, segundo a comparación de métodos de tinción en PMC. O resumo defendible para os estudantes é este: usar o novo azul de metileno como comparador manual normalizado, verificar calquera método local con azul de cresilo brillante fronte a el ou fronte á automatización, e esperar unha maior dispersión coa microscopía manual en calquera dos casos. A bibliografía máis antiga sobre normalización tamén defendía o Azure B purificado como unha alternativa quimicamente máis limpa, porque os lotes comerciais de colorante variaban, no estudo de Marshall sobre Azure B, o que explica por que o grao do reactivo segue aparecendo nas discusións sobre métodos.

Como evitar os erros habituais

Catro erros explican a maior parte das preparacións fallidas. Encargar azul de metileno común en lugar de novo azul de metileno N produce unha tinción débil por razóns químicas, non técnicas. Fixar ou aplicar unha contratinción antes da lectura elimina o sinal supravital. Contar o precipitado do colorante como gránulos eleva artificialmente o resultado, algo que evitan a regra dos dous gránulos e o colorante filtrado. Contar demasiado poucas células con porcentaxes baixas de reticulocitos produce unha cifra que parece precisa, pero ten límites de confianza amplos. Todos os erros teñen o mesmo patrón: quen realiza a microscopía culpa o microscopio do que xa quedou determinado na etapa do reactivo.