Medición dos efectos mitocondriais do azul de metileno: osíxeno, ATP e potencial de membrana

Supoñamos que un laboratorio engade azul de metileno a mitocondrias coa respiración alterada e observa un aumento do consumo de osíxeno. O natural sería escribir que o colorante restableceu a función mitocondrial. Esa frase pode ser incorrecta. O fluxo de osíxeno, a síntese de ATP e o potencial de membrana son tres conceptos distintos. Comparten o mesmo orgánulo do mesmo xeito que as copias de seguridade, a sincronización e o uso compartido comparten un cartafol na nube: están relacionados, pero réxense por regras diferentes. Se se confunde un con outro, a interpretación falla, mesmo cando todas as medicións son tecnicamente correctas.

O azul de metileno favorece esta confusión porque participa no sistema que mide. É un composto que realiza ciclos redox, acepta electróns en etapas anteriores e dóaos en etapas posteriores; é un catión lipófilo que se acumula en mitocondrias enerxizadas; e é un composto de cor azul intensa que absorbe e emite luz nas mesmas bandas ca as sondas habituais. Unha soa medición non pode dar conta de todo iso. O enfoque fiable, demostrado nos estudos mitocondriais de Budapest, consiste en medir o fluxo de osíxeno, a taxa de síntese de ATP, o potencial de membrana e a liberación de peróxido de hidróxeno, con controis específicos para o colorante en cada paso.

A respirometría mide o fluxo de osíxeno, non a produción de enerxía

A respirometría de alta resolución, xa sexa mediante Oroboros Oxygraph ou un analizador de fluxo extracelular Seahorse, informa dunha soa cousa: a velocidade á que se reduce o osíxeno. Non indica cantos protóns se bombearon por electrón, canto gradiente se conservou nin se a ATP sintase o utilizou.

O vocabulario importa. Nas mitocondrias illadas, o substrato sen ADP produce respiración de fuga, o substrato con ADP saturante permite medir a capacidade de fosforilación oxidativa e a titulación cun desacoplante permite medir a capacidade máxima de transferencia de electróns. Nas células intactas, os equivalentes de Seahorse son a respiración basal, a respiración ligada ao ATP sensible á oligomicina, a fuga de protóns, a respiración máxima definida polo FCCP e o consumo de osíxeno non mitocondrial resistente á rotenona máis antimicina. Denominar as medicións de Seahorse Estado 3 e Estado 4 atribúelles unha precisión que a preparación non permite, como deixa claro o marco do Mito Stress Test de Agilent.

O azul de metileno rompe a relación intuitiva entre máis osíxeno e máis enerxía. En mitocondrias illadas de cerebro de cobaia, entre 100 nM e 1 uM de colorante aumentaron o consumo de osíxeno en repouso cos substratos glutamato máis malato, succinato e alfa-glicerofosfato, cun aumento aproximado do 64 por cento co alfa-glicerofosfato; con todo, a respiración estimulada por ADP nas mitocondrias sas permaneceu practicamente sen cambios, segundo o estudo de mitocondrias cerebrais illadas. Como a respiración de fuga aumentou mentres o fluxo estimulado por ADP se mantivo estable, o cociente de control respiratorio calculado diminúe. Esa diminución non significa que o colorante danase as mitocondrias. Significa que o colorante engadiu un ciclo redox que consume osíxeno á respiración normal. Un ensaio de consumo de osíxeno con azul de metileno que só informa do aumento mediu unha reacción química real, pero non dixo nada sobre a conservación da enerxía.

Os experimentos de recuperación mostran a mesma diferenza a maior escala. Co complexo I bloqueado, o fluxo de osíxeno recuperouse aproximadamente ata o triplo, mentres que a síntese de ATP só aumentou unhas 1.5 veces. Chegou máis osíxeno ao eléctrodo. Unha menor proporción dese osíxeno contribuíu á produción de ATP. Calquera afirmación de mellora da fosforilación oxidativa precisa incluír a parte correspondente ao ATP, idealmente expresada como un cociente ATP por osíxeno coa convención do denominador indicada.

Os ensaios de ATP miden a taxa de síntese, que non se pode substituír polo contido

Un ensaio de ATP responde a unha pregunta diferente: canto ATP se xera por unidade de tempo. Unha medición cinética, xa sexa mediante a luminiscencia da luciferase de vagalume rexistrada durante varios minutos ou mediante un ensaio acoplado de hexocinase máis glicosa-6-fosfato deshidroxenase medido a 340 nm, proporciona unha taxa. Unha única medición final do ATP total proporciona o contido, que reflicte a síntese menos o consumo e, por si só, di pouco sobre a fosforilación oxidativa.

O grupo de Budapest empregou o método enzimático acoplado coa adenilato cinase inhibida e observou que o azul de metileno entre 1 e 2 uM aumentaba de maneira modesta pero significativa a produción de ATP en mitocondrias tratadas con rotenona e con antimicina. É unha recuperación real, e é parcial. O estudo de toxicidade do TEGDMA chegou a un resultado do mesmo tipo nun modelo diferente: 5 mM do monómero dental TEGDMA reduciron drasticamente a respiración ligada ao complexo I de aproximadamente 286 a 28 unidades de fluxo, e 2 uM de colorante restablecérona ata aproximadamente 86.

Hai dous controis imprescindibles cun composto coloreado con actividade redox. Primeiro, empregar oligomicina para determinar que proporción da síntese de ATP medida depende da ATP sintase. Segundo, realizar un ensaio de recuperación de ATP engadido, sen células, cunha cantidade coñecida de ATP, o reactivo completo e as concentracións exactas de colorante utilizadas, como mínimo 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM e 2 uM. O colorante pode absorber a luz emitida, inhibir o encima indicador ou alterar a química redox do reactivo, e as orientacións xerais para ensaios de luciferase recomendan probas bioquímicas de control precisamente para este tipo de interferencia. Non se debe supoñer que 1 uM está libre de artefactos porque a extinción da fluorescencia adoite ser maior a concentracións máis altas.

As sondas de potencial de membrana miden a distribución do colorante, non o fluxo

A safranina O, TMRM e TMRE, a rodamina 123 e JC-1 son catións permeables á membrana. Acumúlanse na matriz con carga negativa segundo o equilibrio electroquímico, polo que a fluorescencia global informa indirectamente do potencial a través da localización da sonda. Ningunha delas mide o ATP nin o fluxo de electróns.

Cada sonda ten unha preparación preferente. A safranina O é axeitada para mitocondrias illadas e células permeabilizadas, normalmente arredor de 2 uM, con excitación próxima a 495 nm e emisión próxima a 585 nm, nun réxime de extinción no que a captación modifica a fluorescencia global. TMRM e TMRE son axeitadas para células intactas con cargas nanomolares baixas en modo sen extinción, no que a despolarización libera o colorante e diminúe a fluorescencia mitocondrial; con cargas altas, a dirección do sinal pode inverterse por autoextinción. JC-1 proporciona un cociente verde/vermello práctico, pero depende da carga e da masa mitocondrial, o que a fai menos axeitada para o traballo cuantitativo ca TMRM baixo un control coidadoso. Estas vantaxes e limitacións resúmense nunha revisión de sondas de potencial de membrana mitocondrial amplamente utilizada.

O azul de metileno causa interferencias ópticas precisamente nas concentracións de traballo. As súas bandas de absorción próximas a 600 a 665 nm solápanse coa emisión vermella das sondas, polo que os efectos de filtro interno, a extinción e a absorción da luz de excitación son posibilidades plausibles. O colorante é tamén un segundo catión lipófilo cuxa propia distribución cambia co potencial que se está a medir. A protección consiste en combinar redundancia e brancos: sonda soa, colorante só, sonda máis cada concentración de colorante, despolarización completa con FCCP como referencia de cero e, idealmente, unha segunda sonda con propiedades ópticas distintas. O estudo da vía alternativa ao complexo III estableceu ese precedente ao repetir a recuperación do potencial de membrana tanto con safranina O como con TMRM tras a inhibición con antimicina e mixotiazol, e obter a mesma recuperación cualitativa. Un indicador óptico é un indicio. Dous indicadores independentes son unha proba.

Tres preparacións, tres preguntas diferentes

As mitocondrias illadas, as células permeabilizadas e as células intactas non son axustes de sensibilidade intercambiables dun mesmo ensaio. Son conceptos distintos con principios operativos diferentes.

As mitocondrias illadas conservan a cadea de transporte de electróns, a membrana interna e a maquinaria da matriz, pero eliminan a membrana plasmática, o citosol e a arquitectura da rede. Esa eliminación é o obxectivo: os substratos, o ADP, os inhibidores e as concentracións de colorante defínense con exactitude, polo que se pode identificar unha vía. O custo é a perda da subministración natural de substratos, da sinalización e da demanda.

As células permeabilizadas manteñen as mitocondrias dentro de boa parte da súa arquitectura celular, ao tempo que permiten o paso de substratos exóxenos e ADP a través da membrana plasmática aberta. Son a ferramenta axeitada para identificar un defecto nunha vía de utilización de substratos dentro dun contexto celular. Unha permeabilización excesiva dana a membrana externa, e a regulación citosólica pérdese co lavado.

As células intactas consérvano todo: a barreira da membrana plasmática, os redutores citosólicos, o transporte de substratos endóxenos, a rede mitocondrial e a demanda de ATP. Son as máis próximas á fisioloxía e as máis afastadas do mecanismo, porque a captación, a redución e o secuestro do colorante determinan a exposición mitocondrial efectiva.

O estudo do TEGDMA utilizou os tres niveis de maneira deliberada: mitocondrias cerebrais illadas para estudar a recuperación da oxidación e do potencial polo colorante; células nai da polpa dental permeabilizadas, principalmente para localizar a alteración na oxidación de substratos ligada ao complexo I; e células nai intactas para avaliar o efecto fisiolóxico neto de 2 uM de colorante sobre o consumo de osíxeno inhibido. Para quen compare medicións mitocondriais entre preparacións, o artigo complementario sobre como o azul de metileno move electróns pola cadea respiratoria explica as vías implicadas, e a guía para interpretar estudos de respiración con azul de metileno aborda a lóxica das doses e dos inhibidores.

Controis que require un colorante con actividade redox

Un composto que realiza ciclos redox precisa unha lista de controis máis longa ca un inhibidor ordinario, porque as reaccións químicas do colorante por si só poden imitar procesos biolóxicos.

Para a respirometría, empregar unha cámara só con tampón para avaliar a deriva, unha cámara con tampón máis colorante sen material biolóxico, colorante máis calquera redutor extracelular presente no ensaio e, ao final, rotenona máis antimicina para definir o consumo de osíxeno non mitocondrial nas células intactas. Cómpre ter en conta que o colorante reducido se reoxida ao transferir electróns ao osíxeno para formar peróxido de hidróxeno, polo que un branco só con colorante e sen un doador de electróns subestima o consumo de osíxeno sen células que aparece cando hai NADH ou NADPH dispoñible.

Para o peróxido de hidróxeno, é preferible empregar Amplex UltraRed calibrado máis peroxidase de ravo picante en lugar de colorantes DCFDA non selectivos, verificar con catalase e comprobar a dependencia da iluminación, xa que o colorante é un fotosensibilizador. O estudo de mitocondrias cerebrais observou que a carga de peróxido aumentaba máis de catro veces con só 100 nM de colorante, mentres que a eliminación se ralentizaba, e que o peróxido se formaba directamente a partir do colorante reducido sen un intermediario superóxido. Os detalles sobre a elección da sonda e os controis de luz corresponden ao artigo complementario sobre a medición de especies reactivas do osíxeno en experimentos con colorantes, e a cuestión máis ampla de cando o peróxido actúa como sinal ou como carga abórdase xunto co equilibrio redox celular e as afirmacións sobre antioxidantes.

Para as afirmacións sobre vías, probar os dous sitios de inhibición do complexo III: antimicina A no sitio Qi e mixotiazol no sitio Qo, ademais dunha proba final do complexo IV con cianuro. Un estudo anterior en cerebro de rato informou de que o colorante recuperaba a respiración bloqueada por rotenona, pero non a bloqueada por antimicina, mentres que o estudo posterior en tres especies atopou unha recuperación parcial con ambos os inhibidores e probas de redución directa do citocromo c. Cómpre considerar a vía alternativa compatible cos datos máis recentes, pero non demostrada definitivamente, xa que a concentración de colorante, o sitio de inhibición, o estado dos substratos e a distribución do colorante modifican a ruta observada.

Matriz de selección de ensaios

Utilice esta táboa para escoller a medición a partir da pregunta, e non ao revés.

Para que unha afirmación resulte minimamente convincente, cómpre avaliar as mesmas concentracións de colorante, 100 nM, 300 nM, 1 uM e 2 uM, mediante o fluxo de osíxeno en condicións de fuga, ADP, oligomicina e desacoplante; a taxa de síntese de ATP; o potencial de membrana, preferiblemente con dúas sondas; e a liberación de peróxido calibrada, con catalase e controis sen células. Debe presentarse o conxunto relacionado: fluxo de osíxeno máis taxa de ATP máis ATP por osíxeno máis potencial máis peróxido. Calquera deses valores por separado é unha medición á procura dun significado.