Artigo
Azul de metileno e óxido nítrico: NOS, cGMP e sinalización vascular
A pregunta parece sinxela: o azul de metileno inhibe o óxido nítrico? No laboratorio, a resposta divídese en catro preguntas independentes, e cada unha require unha proba experimental distinta. Confundilas é a principal razón pola que os textos sobre o azul de metileno e o óxido nítrico soan seguros, pero imprecisos.
Pense no sinal de óxido nítrico como nunha cadea de catro elos. Transcríbese un xene para producir óxido nítrico sintase. O encima converte a arxinina en óxido nítrico. O gas difúndese ata o seu destino antes de reaccionar con outra substancia. A guanilato ciclase soluble detéctao e produce GMP cíclico. Publicáronse efectos do azul de metileno en todos os elos, pero as probas proceden de preparacións, concentracións e isoformas diferentes. Un resultado nun elo non demostra unha acción noutro.
A cadea canónica, explicada con claridade
Na parede dun vaso sanguíneo, a secuencia habitual é a seguinte. Un estímulo actúa sobre unha célula endotelial. A óxido nítrico sintase endotelial, chamada eNOS ou NOS3, produce un pequeno pulso de óxido nítrico. O gas difúndese cara á célula de músculo liso veciña, únese ao grupo hemo con ferro reducido da guanilato ciclase soluble e acelera a conversión de GTP en GMP cíclico. O GMP cíclico activa a proteína quinase G, cambia a regulación do calcio e o músculo reláxase.
Hai unha segunda cadea que convén manter separada. Durante unha infección ou a exposición a citocinas, as células transcriben un encima distinto, a óxido nítrico sintase inducible ou iNOS, tamén chamada NOS2. Produce fluxos de óxido nítrico maiores e máis duradeiros ca eNOS. Unha terceira isoforma, a NOS neuronal ou nNOS, pertence a outro contexto. Cando un artigo di óxido nítrico sintase sen especificar a isoforma, detéñase e comprobe cal se mediu. A visión xeral de como o azul de metileno move electróns sinala o mesmo para as dianas redox en xeral: o intermediario non fai nada por si só, e o seu interlocutor en cada extremo determina o resultado.
O GMP cíclico medido tamén é unha lectura integrada, non un ensaio directo do encima. O seu nivel reflicte a síntese pola ciclase menos a degradación polas fosfodiesterases, especialmente PDE5 no músculo liso vascular. Un descenso do GMP cíclico significa, polo tanto, que chegou menos sinal ao detector. Por si só, non identifica o elo que fallou.
Elo 1: prodúcese menos encima iNOS
En macrófagos de rato estimulados con lipopolisacárido bacteriano, interferón gamma ou ambos, o azul de metileno impediu o aumento esperado da proteína iNOS e reduciu intensamente o ARN mensaxeiro de iNOS nos experimentos de transcrición en macrófagos. O máis informativo é o que non cambiou. A degradación do inhibidor I kappa B alfa, a fosforilación de NF kappa B e STAT1 e o movemento deses factores cara ao núcleo mantivéronse en gran medida intactos. O que diminuíu foi a súa unión ao ADN, confirmada mediante inmunoprecipitación da cromatina, que mostrou unha menor ocupación do promotor de iNOS.
Trátase dun efecto de regulación xénica previo á abundancia do encima, non dun bloqueo agudo dun encima xa existente. Pertence á sinalización inflamatoria, na que os factores de transcrición deben unirse a un promotor antes de que apareza a proteína. Non di nada directamente sobre a eNOS constitutiva nun vaso en repouso, e debe describirse neses termos.
Elo 2: o encima NOS existente funciona máis amodo
Un estudo en ratas examinou un nivel diferente. Ratas macho conscientes recibiron lipopolisacárido por vía intravenosa e, tres horas despois, recibiron solución salina ou azul de metileno a 3 mg por kg por vía intravenosa. A actividade da óxido nítrico sintase no hipotálamo basal medial mediuse mediante a conversión de arxinina marcada en citrulina no estudo da actividade de NOS no hipotálamo. Só o estrés xunto coa solución salina induciu certa actividade independente do calcio, e o lipopolisacárido elevouna ata aproximadamente dez veces o nivel de control. O azul de metileno eliminou ambos os compoñentes inducidos. A actividade constitutiva dependente do calcio non cambiou nese tecido con esa dose e nese momento.
Interprete ese resultado exactamente como está escrito: reduciuse a actividade medida de tipo iNOS nesas condicións. Non é unha medición da expresión xénica nin unha proba de selectividade permanente por iNOS fronte a eNOS ou nNOS. Os traballos con encimas purificados reforzan esta cautela. En ensaios directos de óxido nítrico sintase purificada, o azul de metileno bloqueou por completo a formación de citrulina a 30 micromolar, cunha concentración de inhibición do 50 % próxima a 5.3 micromolar sen superóxido dismutase e a 9.2 micromolar con ela, segundo a comparación de NOS purificada e guanilato ciclase. Outro estudo con nNOS purificada implicou a oxidación do grupo hemo unido ao encima. A lección práctica é que a inhibición directa de NOS é real en sistemas illados, pero o resultado no hipotálamo non pode estenderse a unha afirmación xeral de que o azul de metileno deixa intactas todas as NOS constitutivas en todas partes.
Elo 3: o óxido nítrico pérdese antes de chegar
A demostración máis clara de que algo distinto do bloqueo enzimático pode explicar un descenso do GMP cíclico procede de células de músculo liso da arteria pulmonar de coello cultivadas. O deseño prescindiu por completo da NOS endóxena ao engadir directamente doadores de óxido nítrico, e despois examinou se o azul de metileno seguía reducindo a resposta de GMP cíclico no estudo do superóxido no músculo liso vascular.
Probáronse tres doadores de 1 a 100 micromolar: S nitroso L cisteína, nitroprusiato de sodio e un análogo desaminado estable chamado MPANO. Todos elevaron o GMP cíclico entre aproximadamente 1.5 e 12 veces. O azul de metileno a 10 micromolar inhibiu os dous primeiros entre un 51 e un 100 por cento e deixou inalterada a resposta a MPANO. Se o azul de metileno simplemente bloquease o sitio catalítico da ciclase, esa selectividade entre doadores sería difícil de explicar, porque os tres converxen no mesmo encima posterior.
Tres controis vincularon despois o mecanismo ao superóxido. Primeiro, a xeración de superóxido extracelular con xantina e xantina oxidase reproduciu o mesmo patrón: bloqueo de CYSNO e nitroprusiato, sen afectar a MPANO. Segundo, o azul de metileno provocou unha produción de superóxido nas células de músculo liso dependente da dose e do tempo, medida mediante a redución do citocromo c. Terceiro, a superóxido dismutase impediu por completo a inhibición, mentres que a catalase non o fixo, o que apunta ao superóxido, e non ao peróxido de hidróxeno, como especie directamente responsable nesa preparación.
Paga a pena describir a versión do experimento en cocultivo porque sitúa o efecto no espazo. As células endoteliais sobre cubreobxectos cocultiváronse brevemente con células de músculo liso, de modo que o factor endotelial liberado en condicións basais elevou o GMP cíclico do músculo liso entre tres e oito veces. O pretratamento de calquera dos dous compartimentos con azul de metileno reduciu ese sinal, e a superóxido dismutase reverteu parcialmente o efecto do pretratamento endotelial. Noutras palabras, o azul de metileno non ten por que actuar dentro da célula detectora de músculo liso. Pode reducir o sinal ao eliminar o mensaxeiro durante o seu tránsito. A guía para ler investigacións sobre o azul de metileno trata isto como unha regra xeral: identifique o compartimento no que tivo lugar a intervención antes de nomear unha diana molecular.
Chamar a isto inhibición de NOS sería incorrecto. Os doadores non precisaban ningún paso de síntese mediante a sintase para funcionar e, con todo, o sinal diminuíu.
Elo 4: o propio detector responde menos
Existen efectos directos sobre a guanilato ciclase soluble, pero as concentracións importan. Na comparación de encimas purificados citada antes, a ciclase estimulada por óxido nítrico precisou arredor de 60 micromolar de azul de metileno para unha inhibición do 50 %, fronte á concentración próxima a 5 a 9 micromolar para a mesma inhibición de NOS, e mesmo 1 millimolar só produciu un bloqueo máximo parcial. Iso supón unha diferenza de aproximadamente seis a once veces. Por tanto, un experimento celular a concentracións micromolares baixas que reduza o GMP cíclico non pode cualificarse como inhibición selectiva da ciclase baseándose só no valor do GMP cíclico.
Un estudo redox posterior engadiu unha segunda cautela: o azul de metileno desactivou a ciclase activada por óxido nítrico mediante un mecanismo distinto da simple oxidación polo aire do ferro do grupo hemo. Así pois, o detector pode verse afectado, pero a química non está resolta, e a diferenza entre concentracións implica que, con exposicións micromolares baixas, primeiro deben descartarse os efectos do superóxido e de NOS. Aquí tamén corresponde controlar as fosfodiesterases. A menos que se medise ou bloquease a degradación, unha menor acumulación de GMP cíclico é compatible cunha síntese menor, cunha degradación máis rápida ou con ambas.
Por que isto non se reduce a unha única afirmación sobre a presión arterial
Cada elo estableceuse nun sistema diferente. A transcrición nos macrófagos non é a actividade enzimática no hipotálamo. A actividade hipotalámica tras o lipopolisacárido non é o ton endotelial en repouso. O factor endotelial liberado en condicións basais nun cocultivo non é a vasodilatación estimulada por un agonista. As células da arteria pulmonar cultivadas con azul de metileno a 10 micromolar non son unha circulación humana. Reducir todo isto a unha afirmación como que o azul de metileno aumenta a presión arterial ao bloquear o óxido nítrico descarta precisamente as distincións que os controis se deseñaron para preservar.
Tres comprobacións manteñen o rigor da explicación. Primeiro, identifique a isoforma: eNOS para o ton vascular en repouso, iNOS para o fluxo inflamatorio inducido e nNOS para os contextos neuronais e algúns contextos con encimas purificados. Segundo, identifique como se achega o sinal de óxido nítrico: síntese endóxena, liberación endotelial basal ou un doador específico como CYSNO, nitroprusiato ou MPANO, xa que o doador estable resistiu o azul de metileno mentres que os lábiles non. Terceiro, indique a concentración e a reversión do efecto: a reversión mediante superóxido dismutase implica o superóxido, a falta de efecto da catalase apunta en contra do peróxido de hidróxeno nesa preparación, a reprodución do efecto mediante xantina oxidase demostra que ese mecanismo é suficiente e os ensaios con encimas purificados separan os efectos directos sobre a catálise das perdas durante o tránsito.
A síntese breve é esta. É máis axeitado considerar o azul de metileno como un axente que altera en varios puntos a sinalización do óxido nítrico ao GMP cíclico ca como un bloqueador selectivo da ciclase. Segundo a preparación e a concentración, pode reducir a unión dos factores de transcrición de iNOS, inhibir directamente os encimas NOS, diminuír a dispoñibilidade de óxido nítrico mediante a xeración de superóxido e alterar a ciclase activada por óxido nítrico. O papel da sinalización do GMP cíclico nos estudos vasculares e a comparación dos doadores de óxido nítrico empregados en ensaios celulares abordan cada un unha desas ramas con máis detalle, e os métodos empregados para separar os efectos redox dos efectos enzimáticos explican por que a combinación de superóxido dismutase, catalase e un control cun doador estable aparece tan a miúdo nesta bibliografía.
Un valor baixo de GMP cíclico tras o azul de metileno identifica unha cadea rota. Só os controis indican que elo rompeu.