Azul de metileno, Nrf2 e bioxénese mitocondrial: unha explicación

Hai unha frase que aparece a miúdo nos textos sobre o azul de metileno: activa Nrf2 e crea novas mitocondrias. A frase lese como unha única afirmación, pero contén dous conceptos distintos, estudados en sistemas diferentes e con tipos de probas diferentes. O primeiro é unha vía de sinalización, un sensor que activa xenes de defensa. O segundo é un programa de construción, unha célula que fabrica máis maquinaria mitocondrial. Un sinal pode desencadear a construción, pero demostrar que se emitiu o sinal non é o mesmo que demostrar que se levantou o edificio, e demostrar que hai máis material de construción non é o mesmo que demostrar unha mellor subministración de enerxía. Este artigo mantén separadas esas tres cousas.

O concepto de Nrf2: un sensor, non un escudo

Nrf2 (factor 2 relacionado co factor nuclear eritroide 2) é un factor de transcrición, unha proteína cuxa función é activar xenes. En condicións de repouso, unha proteína sensora chamada Keap1 reténo no citoplasma e entrégao á maquinaria de eliminación da célula para a súa destrución continua. Cando os oxidantes ou os electrófilos modifican as cisteínas reactivas de Keap1, a eliminación detense. O Nrf2 recentemente sintetizado acumúlase, desprázase ao núcleo, asóciase con pequenas proteínas Maf e únese a secuencias de ADN chamadas elementos de resposta antioxidante. Esa unión activa un conxunto de xenes de defensa.

Os indicadores canónicos desta vía son específicos. NQO1 (NAD(P)H quinona deshidroxenase 1) e TrxR1 (tiorredoxina redutase 1) están entre os xenes diana de Nrf2 máis fiables. HO-1 (hemo osixenase-1) é fortemente inducible, pero tamén responde a outros reguladores. Enzimas como a SOD e a catalase forman parte da maquinaria antioxidante, pero os seus niveis están controlados por moitos factores de transcrición, polo que un aumento da SOD non demostra por si só que Nrf2 fose a causa. As probas máis próximas ao evento de sinalización son a acumulación de Nrf2 no núcleo, a activación dun xene reporteiro ARE ou a indución de dianas canónicas que desaparece cando se elimina Nrf2. Todo o demais —niveis máis baixos de oxidantes, mellor supervivencia baixo estrés, máis glutatión— é un efecto posterior que poden producir moitas vías.

O primeiro resultado co azul de metileno nesta historia sitúase preto dese extremo da escala. Os fibroblastos expostos a azul de metileno en concentracións nanomolares mostraron un atraso da senescencia xunto cun maior contido de complexo IV, un maior consumo de osíxeno e a indución das enzimas de fase-2 TrxR1 e NQO1, segundo se recolle no estudo que relacionou por primeira vez o azul de metileno coa mellora mitocondrial e o atraso da senescencia. TrxR1 e NQO1 son precisamente as dianas canónicas de Nrf2 que unha persoa que le con atención quere ver. O que o estudo non mostrou foi o propio evento de sinalización: non houbo medición de Nrf2 nuclear, nin xene reporteiro ARE, nin control con eliminación de Nrf2. Así que a interpretación rigorosa é que o azul de metileno induce xenes diana coñecidos de Nrf2 neste sistema, o que é compatible coa activación de Nrf2, pero non identifica Nrf2 como causa de forma illada. A indución dun xene diana está un paso despois do interruptor.

O concepto de bioxénese: un programa con tres puntos de control

A bioxénese mitocondrial é o programa polo que unha célula xera máis capacidade mitocondrial. A súa xerarquía, tal como se describe nos manuais, pasa por tres puntos de control. Primeiro, o coactivador PGC-1alpha activa o programa. Segundo, os factores de transcrición nucleares (para aumentar a confusión, un deles chámase NRF1, factor respiratorio nuclear 1, unha proteína distinta de Nrf2) impulsan a expresión de xenes mitocondriais, entre eles TFAM, que mantén e replica o ADN mitocondrial. Terceiro, a célula acaba con máis xenomas mitocondriais e máis maquinaria respiratoria, medibles como número de copias de ADNmt, actividade da citrato sintase ou abundancia e actividade dos complexos respiratorios.

Cada punto de control sustenta unha afirmación máis débil ou máis forte que o anterior. Un nivel máis alto de ARN mensaxeiro de PGC-1alpha ou TFAM mostra que se solicitou o programa, non que se completase. Máis ADNmt ou máis proteína do complexo IV indican máis material, pero unhas mitocondrias remodeladas poden presentar o mesmo aspecto. Unha mellor respiración, un maior consumo de osíxeno ou unha maior actividade dos complexos mostran que a función cambiou, pero a función pode mellorar sen que haxa ningunha mitocondria nova. Unha afirmación sólida de bioxénese combina os tres elementos: regulador, contido e función.

O estudo posterior con fibroblastos percorreu a maior parte desa cadea. En células humanas IMR90 tratadas con azul de metileno a 100 nanomolar, a relación entre NAD e NADH aumentou transitoriamente nos primeiros 15 minutos e volveu ao nivel basal nun día. A ese sinal enerxético transitorio seguiulle unha fosforilación transitoria do sensor enerxético AMPK, e despois a indución de PGC-1alpha e de SURF1, unha proteína necesaria para ensamblar un complexo IV funcional. A actividade do complexo IV aproximadamente duplicouse, os oxidantes celulares diminuíron arredor dun 28 por cento e os telómeros erosionáronse máis lentamente. A secuencia completa descríbese no artigo que relaciona a actividade redox do azul de metileno coa AMPK e a bioxénese mitocondrial.

Dous detalles dese artigo merecen atención porque son do tipo que adoita omitirse. Primeiro, o patrón importou máis que a presenza: o azul de metileno activou a AMPK de maneira transitoria, mentres que o fármaco de referencia AICAR a activou de maneira crónica, e o activador transitorio atrasou a senescencia cunha eficacia unhas oito veces maior. Polo tanto, unha afirmación como «o azul de metileno activa a AMPK» é incompleta; a afirmación relevante é que activa a AMPK de maneira transitoria, e a comparación suxire que a activación crónica non produce o mesmo efecto. Segundo, o azul de metileno non alterou o ciclo celular, o que descarta a explicación alternativa máis trivial: que as células simplemente se dividisen máis lentamente e parecesen máis novas por iso.

A rama dos ratos: comportamento, xenomas e un desencadeante deliberadamente paradoxal

Un grupo que estudaba ratos de mediana idade ampliou o traballo con cultivos celulares a animais. Tras 60 días de azul de metileno por vía oral, os ratos tratados conservaron máis a súa resistencia física e o seu comportamento exploratorio, e mostraron menos comportamentos semellantes á ansiedade que os ratos envellecidos sen tratar. No tecido cerebral, os xenes cuxa expresión diminuíra co envellecemento —NRF1, TFAM, SOD2 e a subunidade COX1 do complexo IV— recuperaron niveis próximos aos da idade adulta, e o número de copias de ADNmt aumentou. Eses resultados, que combinan comportamento, regulador e abundancia de xenomas, recóllense no estudo en ratos de mediana idade sobre o azul de metileno e a bioxénese mitocondrial cerebral.

O desencadeante proposto é a parte interesante, porque contradí a explicación simple de que o azul de metileno é un antioxidante. Os ratos tratados mostraron unha maior xeración de especies reactivas de osíxeno nas mitocondrias cerebrais, en concreto peróxido de hidróxeno. A proposta dos autores: un sinal leve de peróxido é o que activa a vía de Nrf2, que despois impulsa o programa de bioxénese. Neste modelo, o azul de metileno é prooxidante na fase desencadeante e antioxidante na fase do resultado, un patrón que os farmacólogos chaman hormese, no que un pequeno estrés provoca unha defensa maior que o propio estrés. Non se comprobou directamente se ese aumento do peróxido causa realmente a activación de Nrf2; é a ponte proposta, non unha ligazón medida.

Un estudo complementario do mesmo grupo puxo a proba a vertente de seguridade desa proposta. En mitocondrias cerebrais illadas, o azul de metileno aumentou a produción de peróxido de hidróxeno a concentracións tan baixas como 50 nanomolar, pero as concentracións terapéuticas non causaron danos detectables no ADN mitocondrial. Só a 100 micromolar, moi por riba dos niveis terapéuticos, determinados fragmentos de ADNmt mostraron danos, e a combinación do colorante a 20 micromolar con luz vermella produciu osíxeno singlete que danou amplamente o ADNmt, o que corresponde ao coñecido comportamento fotosensibilizador do colorante, e non á súa farmacoloxía na escuridade. O tratamento previo mesmo protexeu as mitocondrias do mesencéfalo ventral fronte ás lesións do ADNmt inducidas pola rotenona. A resposta á dose e os controis de xenotoxicidade detállanse no estudo sobre a produción non xenotóxica de peróxido polo azul de metileno.

O medido fronte ao proposto: como ler o diagrama

O diagrama da vía que aparece a continuación elaborouse para este artigo co fin de deixar clara a distinción que vén facendo o texto. Os recadros con bordos continuos representan pasos con apoio experimental directo na literatura sobre o azul de metileno: o ciclo redox que modifica NAD/NADH, a fosforilación transitoria da AMPK, a indución de PGC-1alpha e SURF1, a maior actividade do complexo IV, a indución de NQO1 e TrxR1, a recuperación da expresión de xenes de bioxénese e do número de copias de ADNmt no cerebro de rato, e o aumento do peróxido sen danos no ADNmt a doses terapéuticas. Os recadros con bordos descontinuos representan as ligazóns propostas: a detección do sinal de peróxido por Keap1, a acumulación de Nrf2 no núcleo que impulsa os xenes de defensa, e a frecha causal que vai da activación de Nrf2 ao programa de bioxénese. Eses pasos descontinuos son plausibles, compatibles cos datos e forman parte da bioloxía habitual dos manuais, pero nestes artigos non se mediron cos controis (Nrf2 nuclear, xenes reporteiros ARE, eliminación de Nrf2) que permitirían convertelos en recadros de bordo continuo.

Tres confusións fanse visibles unha vez que se ten o diagrama diante. Primeiro, NRF1 e Nrf2 son proteínas distintas con nomes case idénticos; o estudo en ratos mediu o factor respiratorio nuclear 1, un regulador da bioxénese, non o factor de transcrición antioxidante, e confundilos reduce todo o diagrama a un único nodo. Segundo, a expresión xénica é o inicio da historia, non o final; a recuperación dos ARN mensaxeiros de TFAM ou COX1 apoia a existencia dunha solicitude de bioxénese, mentres que o número de copias de ADNmt e a actividade do complexo IV son as probas de que esa solicitude se cumpriu. Terceiro, o resultado antioxidante non demostra a vía de Nrf2; a diminución do 28 por cento dos oxidantes nos fibroblastos e a protección fronte á rotenona nos ratos son efectos posteriores reais, pero varias vías converxen neles.

Que permitiría converter un recadro descontinuo nun continuo

Os experimentos que faltan son habituais. A medición da proteína Nrf2 nuclear tras a exposición ao azul de metileno, cunha evolución temporal axustada ao sinal transitorio da AMPK, permitiría comprobar se as dúas ramas se activan realmente ao mesmo tempo, como afirma a hipótese de activación sincronizada. Un xene reporteiro controlado por ARE confirmaría a actividade transcricional en lugar de inferila a partir dos xenes diana. Repetir as medicións de bioxénese coa expresión de Nrf2 reducida ou co seu xene eliminado permitiría comprobar directamente a frecha causal: se a indución do complexo IV e os aumentos de ADNmt persisten sen Nrf2, a ponte é incorrecta e a rama da AMPK produce o efecto por si soa. Nos animais, un estudo de administración crónica cos mesmos tres puntos de control —regulador, contido e función— permitiría comprobar se o programa permanece activo ou se adapta. Ata entón, a activación sincronizada das vías de enerxía e defensa segue sendo o que os seus autores dixeron: un posible factor clave, non un mecanismo establecido.

Quen chegue desde o ámbito máis amplo da farmacoloxía pode querer o contexto que rodea este tema: como o azul de metileno transporta electróns a nivel mitocondrial, que outros efectos ten sobre as mitocondrias e a enerxía celular, que lugar ocupan os achados sobre a senescencia na investigación do envellecemento, como se relacionan as afirmacións sobre a bioxénese co rendemento cognitivo, e os datos de seguridade que delimitan toda discusión sobre a dosificación. Cada un deles é un concepto separado coas súas propias probas, e cada un merece o mesmo tratamento de distinción entre o medido e o proposto que este artigo lle deu a Nrf2.