O azul de metileno como indicador de anaerobiose e osíxeno: que demostra o cambio de cor

Unha técnica sela un frasco de anaerobiose, comproba a tira indicadora de azul de metileno a través da tapa e ve o que quere ver. A tira pasou de azul a branca. Rexistra o ensaio como anaerobio e continúa co seu traballo. Dous días despois, nunha placa non medra nada, mentres que un tubo selado con caldo dentro do mesmo frasco mostra sinais de exposición ao osíxeno. A tira dicía a verdade. Ela fíxolle a pregunta equivocada.

A confusión é conceptual. Un indicador de anaerobiose con azul de metileno responde a un concepto redox, non a un concepto de esterilidade nin de validación de todo o sistema. Unha vez clara esa distinción, a tira convértese nun instrumento preciso e fiable cunha función moi delimitada.

O concepto: un par redox reversible

O azul de metileno disolto existe en dous estados. A forma oxidada é o coñecido catión azul. A forma reducida, chamada azul de leucometileno, é incolora. Preto dun pH neutro, a semirreacción simplificada consiste nun catión azul máis un protón máis dous electróns que producen unha molécula leuco incolora. O potencial formal está preto de máis 11 milivoltios con respecto ao eléctrodo estándar de hidróxeno a pH 7, o que o sitúa nun intervalo que moitos sistemas redutores poden alcanzar e que o osíxeno pode reverter.

A redución necesita un potencial redox local baixo. Eliminar o osíxeno por si só non sempre o consegue. Os primeiros traballos sobre anaerobiose observaron que o azul de metileno en auga simple sen osíxeno conservaba a súa cor a menos que houbese unha substancia redutora, e que as mesturas de caldo de dextrosa con arredor dun 0.01 por cento de colorante se decoloraban facilmente a 37 C, mentres que a mesma mestura mantida a 4 C permanecía azul durante un día, segundo se recolle en experimentos con tecido fresco e condicións de cultivo anaerobio. A temperatura, o pH, a glicosa, o ascorbato, o tioglicolato e a actividade redutora microbiana determinan se os electróns están dispoñibles.

A reoxidación só necesita osíxeno. Cando o aire chega á forma leuco, esta volve converterse na forma azul. Os indicadores modernos deseñados aproveitan precisamente este ciclo: colorante máis redutor máis unha matriz estabilizadora, incoloros con pouco osíxeno e azuis de novo ao expoñelos ao aire, como se demostrou en un indicador híbrido de osíxeno con azul de metileno baseado en colorante, redutor, tensioactivo e arxila. Ese prototipo empregaba colorante a 0.01 milimolar con ascorbato ou glicosa a 2.0 milimolar e pH 11, volvía incoloro preto dun 0.5 por cento de osíxeno en volume e distinguía entre menos dun 0.1 por cento e máis dun 0.5 por cento de osíxeno na súa cámara de ensaio.

Así que o principio de funcionamento é sinxelo. Azul significa que a zona indicadora está oxidada. Incolora significa que a zona indicadora alcanzou condicións redutoras e de baixo osíxeno. O cambio é reversible, local e químico. Por si só non di nada sobre os microbios.

Como funciona unha tira indicadora de azul de metileno nun frasco de anaerobiose

Unha tira indicadora de azul de metileno para un frasco de anaerobiose é unha pequena zona de reacción situada na atmosfera do frasco onde se pode ver sen abrir o recipiente. Os formatos comerciais varían: tiras de papel, comprimidos que se disolven ou humedecen durante a preparación e papeis híbridos máis recentes. Algúns requiren unha pinga de auga destilada para activar a zona de reacción. Outros son dispositivos de formato seco que deben permanecer secos. Debe seguirse a folla de instrucións do produto concreto, porque a hidratación, a colocación e o tempo de lectura forman parte da química.

Na práctica, a lectura prevista é binaria. Azul significa que persiste o osíxeno ou que as condicións na tira non son suficientemente redutoras. Branca ou incolora significa que se estableceron condicións redox anaerobias na tira. Algúns papeis comerciais engaden un pigmento vermello de fondo, polo que o seu estado final reducido se ve rosa en lugar de branco. Cómpre saber que cor final promete o produto antes de avalialo.

O tempo varía segundo o sistema. Nunha montaxe de tipo GasPak, a perda de cor comezou ao cabo de aproximadamente unha hora e completouse nunhas poucas horas, mentres que nunha comparación controlada a temperatura ambiente o azul de metileno necesitou máis de seis horas. Nese traballo, o potencial redox dos medios alcanzou aproximadamente menos 100 milivoltios en 60 a 100 minutos, moito antes de que o colorante rematase de cambiar, e estaba moi por debaixo de menos 200 milivoltios cando a tira quedou totalmente incolora. O indicador responde con atraso respecto á atmosfera. Unha tira azul na primeira hora non demostra un fallo, e unha tira branca na sexta hora describe a tira nesa sexta hora.

A colocación importa polo mesmo motivo. Manteña a tira no espazo de gas, visible a través da tapa, afastada das superficies de ágar e dos medios de cultivo. Informa sobre o seu contorno inmediato. Se a coloca pegada a unha parede fría, a enterra baixo placas ou deixa que o condensado a empape, informará sobre ese microambiente en lugar de sobre o frasco.

Que revela a tira e que non revela

Considere o indicador de azul de metileno do frasco de anaerobiose como un único sensor nun único lugar. Permite establecer as condicións locais de redox e osíxeno na súa propia zona de reacción, que son amplamente representativas do espazo de gas se a mestura e o equilibrio son adecuados. Todo o que vaia máis alá é unha inferencia, e as inferencias necesitan probas independentes.

Unha tira incolora non establece a esterilidade. A esterilidade é a ausencia de organismos viables, demostrada mediante unha esterilización validada e controis de validación do cultivo. Un frasco pode ser completamente anaerobio e estar contaminado, ou ser completamente estéril e seguir sendo aerobio.

Non valida todas as partes do sistema de cultivo. O osíxeno disolto dentro dun tubo selado, o osíxeno atrapado no ágar profundo, os gradientes nun frasco demasiado cheo e unha fuga que se abre despois da lectura escapan ao control dunha soa tira. Os experimentos espaciais mostraron zonas azuis e incoloras adxacentes nun mesmo recipiente, nas que a penetración do osíxeno e a actividade redutora se equilibraban de maneira diferente. Un punto non pode certificar un volume.

Non demostra unha anaerobiose ininterrompida. Unha tira lida unha soa vez durante a preparación non di nada sobre a hora vinte. Os traballos recentes sobre calidade en anaerobiose advirten de que os indicadores químicos describen a atmosfera no momento da lectura e poden parecer satisfactorios malia a presenza de pequenas cantidades de osíxeno residual. É a documentación continua ou en puntos de control, e non unha única ollada ao estado final, a que vincula a tira coa incubación.

Para coñecer a química que explica o cambio de cor, consulte como o azul de metileno alterna entre os estados oxidado e reducido. Para saber como o osíxeno condiciona a manipulación das mostras de forma máis ampla, consulte o control do osíxeno nos traballos de microscopía e cultivo.

Un diagrama para ter xunto ao frasco

A figura seguinte condensa o artigo nunha referencia para a bancada. Tres estados da mesma tira, as dúas direccións da reacción e o límite entre as probas que achega o indicador e a validación do sistema.

Tipos de fallo que manteñen a tira azul ou dan unha falsa seguridade

A maioría dos fallos encaixan en cinco grupos. Cada un ten sinais característicos.

Un frasco ou unha bolsa con fugas segue achegando osíxeno á zona de reacción. A tira permanece azul ou volve azul despois de perder cor. Comprobe a tapa, a xunta, as abrazadeiras e as superficies de selado antes de culpar a química.

Un xerador de gas esgotado ou activado incorrectamente non chega a eliminar o osíxeno. Nos sistemas antigos activados con auga, a ausencia de condensación arredor dos 10 a 15 minutos e a falta de quecemento da tapa arredor dos 20 a 40 minutos eran avisos temperáns propios dese sistema. Un sobre de capacidade insuficiente nun frasco sobrecargado falla do mesmo xeito.

O envelenamento do catalizador só se aplica aos sistemas antigos de hidróxeno máis paladio, nos que o paladio facilita a combinación de hidróxeno e osíxeno para formar auga. A humidade e o sulfuro de hidróxeno degrádano. Moitos sobres actuais non empregan paladio, polo que non aplique esta solución onde non corresponde.

Unha tira degradada ou manipulada incorrectamente falla sen sinais evidentes. O colorante e o redutor perden reversibilidade durante o almacenamento, un dos motivos polos que se desenvolveron formulacións híbridas resistentes á perda de cor pola luz e á degradación durante o almacenamento. Rexeite as existencias caducadas, as que teñan unha cor inicial anormal e as tiras humedecidas cando deberían estar secas ou deixadas secas cando requiren humedecemento.

Un gradiente ou un atraso engana a quen interpreta a lectura, non á química. Un espazo de gas mal mesturado, os tubos selados con osíxeno disolto e os medios semisólidos manteñen as súas propias condicións durante máis tempo do que suxire a tira. As tiras de resazurina pasan polo rosa antes de quedar incoloras e adoitan comercializarse como máis rápidas, pero os seus limiares corresponden á súa propia formulación e non son transferibles ao azul de metileno.

Controis e un protocolo de lectura que paga a pena adoptar

Dous controis económicos detectan a maioría dos erros de interpretación. Manteña unha tira de control nova no aire ambiente xunto ao ensaio. Unha tira de azul de metileno que funciona correctamente permanece azul nese ambiente. Algúns indicadores envasados comezan cunha cor pálida e vólvense azuis ao abrir o envase, o que xa constitúe unha comprobación funcional. Ademais, coloque periodicamente unha tira nova nunha montaxe anaerobia validada previamente. Debería alcanzar o estado final reducido validado dentro do tempo especificado polo produto. Se algún dos dous controis non se comporta como debería, substitúa o lote antes de confiar nas lecturas do frasco.

O protocolo de lectura deriva do mecanismo. Coloque a tira no espazo de gas, nun lugar visible sen abrir o frasco, seguindo a folla do produto no relativo ao contacto coa parede e ao humedecemento. Rexistre a cor inicial, a hora á que se selou o frasco e a cor no punto de control especificado polo produto. Cando o recipiente o permita, rexistre que o indicador permaneceu reducido nos puntos de control definidos durante a incubación. Rexistre a cor final inmediatamente antes de abrir. Esa cor anterior á apertura é o resultado final dese ensaio. Despois de abrir, é de esperar que volva azul; non deixe que iso reescriba o ocorrido.

Se a tira permanece azul pasado o tempo especificado, considere a anaerobiose como non verificada. Revise a cadea por orde: selado, sobre, catalizador se o hai, hidratación e caducidade do indicador e, por último, funcionamento do indicador en comparación co control no aire. Só cando se verifique a atmosfera se debería interpretar o crecemento ou a ausencia de crecemento, empregando unha montaxe de cultivo anaerobio e controis dos organismos axeitados á aplicación.

A tira merece ter a última palabra dentro do seu propio ámbito. Azul ou incolora, responde a unha pregunta sobre un lugar nun momento concreto. Fágalle esa pregunta nos momentos previstos, cos controis ao seu carón, e responderá de maneira fiable. Pregúntelle pola esterilidade, por todos os tubos ou por toda a incubación a partir dunha soa ollada, e ningunha química indicadora poderá salvar a interpretación.