Azul de metileno e exposición á luz: lonxitude de onda, irradiancia e xeometría do tratamento

Dous artigos científicos describen a exposición do azul de metileno a 10 J por cm cadrado de luz. Un mata bacterias. O outro non produce ningún efecto medible. Un lector que compare só a dose conclúe que o campo é inconsistente. O campo é consistente. A dose nunca foi toda a exposición.

Unha exposición á luz é un pequeno sistema de parámetros que actúan conxuntamente: lonxitude de onda, irradiancia, duración, fluencia resultante, dispoñibilidade de osíxeno, concentración e estado de agregación do colorante, intervalo entre o colorante e a luz, e percorrido óptico que a luz realmente atravesa na mostra. Se cambia un, cambia a fotoquímica. Este artigo analiza cada parámetro e despois distingue a fotobiomodulación con infravermello próximo da fotoactivación directa do colorante, porque estes dous réximes son os que se confunden con máis frecuencia.

A lonxitude de onda determina se o colorante participa

O azul de metileno en auga absorbe intensamente a luz vermella en forma de monómero, cun pico arredor de 664 a 665 nm e un ombreiro a unha lonxitude de onda máis curta, arredor de 610 nm, que aumenta a medida que o colorante se agrega en dímeros e agrupacións apiladas máis grandes. O coeficiente de extinción molar preto do pico é da orde de 65,000 a 85,000 M-1 cm-1, polo que as solucións micromolares xa son dun azul intenso. A primeira revisión fotoquímica do azul de metileno con ADN e substratos biolóxicos documenta este comportamento de absorción e a química do estado excitado que lle segue: a absorción poboa un estado singlete de curta duración, que pasa a un estado triplete de maior duración con rendementos descritos próximos a 0.5 e que, nunha solución aireada, é desactivado polo osíxeno nuns 2 microsegundos.

Nese paso de desactivación é onde diverxen as dúas vías fotoquímicas. Na química de tipo II, o colorante en estado triplete transfire enerxía ao osíxeno no estado fundamental e produce osíxeno singlete, con rendementos citados habitualmente próximos a 0.52. Na química de tipo I, o triplete transfire, pola contra, un electrón ou hidróxeno a un substrato, producindo radicais, entre eles especies superóxido e hidroxilo. Ambas poden ter lugar á vez, e o efecto fotodinámico convencional segue a depender moito do osíxeno mesmo cando contribúe o tipo I.

A consecuencia para a selección da lonxitude de onda do azul de metileno é unha regra sinxela. A luz vermella de aproximadamente 630 a 680 nm solápase coa banda do colorante, con 660 a 665 nm preto do máximo do monómero, polo que pode impulsar a química do fotosensibilizador onde haxa unha cantidade apreciable de colorante. O infravermello próximo a 810 nm queda moi fóra da banda de absorción do estado fundamental, polo que é unha lonxitude de onda pouco axeitada para a excitación directa do colorante. A concentración complica o panorama dun xeito concreto: a medida que aumenta, unha maior proporción do colorante está en formas diméricas e agregadas que absorben cara aos 610 nm e fotosensibilizan con menor eficiencia por molécula, polo que duplicar o colorante non duplica o efecto. A revisión complementaria sobre o azul de metileno e a terapia con luz vermella trata esta regra de absorción como condición previa para calquera reacción fotosensibilizada.

A irradiancia, a duración e a fluencia son tres parámetros, non un

A fluencia, en J por cm cadrado, é a irradiancia multiplicada polo tempo. Indicar só a fluencia oculta a velocidade á que chegou a enerxía, e esa velocidade importa.

Unha irradiancia alta aplicada brevemente e unha irradiancia baixa aplicada durante moito tempo poden dar a mesma fluencia cunha química distinta. A irradiancia alta consome o osíxeno disolto máis rápido do que a difusión o repón, o que limita a vía de tipo II dependente do osíxeno durante a exposición. Tamén achega calor, e o tecido responde ao quecemento con cambios no fluxo sanguíneo que alteran tanto a osixenación como a distribución do colorante. A irradiancia baixa durante unha exposición longa mantén a subministración de osíxeno, pero dá tempo aos procesos de reparación e reosixenación para actuar durante a propia exposición. Os libros de texto de fotoquímica chaman reciprocidade ao suposto de que só importa a dose total. Este suposto falla sempre que interveñen o osíxeno, o quecemento ou a bioloxía, o que nos tecidos significa case sempre.

As exposicións fotodinámicas antimicrobianas con azul de metileno en humanos empregan habitualmente de 6 a 18 J por cm cadrado, o que se solapa cos valores de fotobiomodulación. Polo tanto, a fluencia por si soa non permite identificar o réxime. Unha exposición de 10 J por cm cadrado a 660 nm nun tecido que contén colorante é fotoquímica impulsada por un fotosensibilizador. A mesma fluencia a 810 nm nun tecido con trazas de colorante é algo totalmente distinto. O número coincide. O concepto é diferente.

O percorrido óptico e a xeometría da mostra determinan con que se atopa a luz

O comportamento de Beer-Lambert implica que a parte dianteira dunha mostra recibe moita máis luz que a traseira. Nunha cubeta cunha concentración de colorante de decenas de micromolar, o primeiro milímetro pode absorber a maior parte da luz vermella incidente, deixando as capas máis profundas practicamente sen exposición. Se se coloca a mesma solución nun pocillo pouco profundo e cun volume baixo, a exposición vólvese case uniforme. O mesmo colorante, a mesma lámpada, a mesma fluencia na superficie, pero un resultado distinto.

O tecido engade dispersión á absorción. A luz vermella próxima a 660 nm penetra da orde de milímetros, cunha profundidade exacta determinada polo contido sanguíneo, a pigmentación e o tipo de tecido. Os pocillos engaden os seus propios artefactos: efecto de lente do menisco, reflexión nas paredes, sombreado dos pocillos periféricos e quecemento dos volumes pequenos baixo a fonte. Dous laboratorios que indiquen axustes idénticos da lámpada, pero distintos tipos de placa, volumes ou distancias da fonte, realizaron experimentos distintos.

A distancia merece especial atención porque é a variable silenciosa máis común. A irradiancia diminúe rapidamente coa distancia a unha fonte non colimada, polo que mover unha lámpada de 2 cm a 5 cm por riba da placa pode reducir a irradiancia varias veces mentres a sección de métodos segue a dicir o mesmo. Sen unha irradiancia medida na superficie da mostra, as fluencias publicadas e calculadas a partir das potencias nominais do fabricante son estimacións, non medicións.

Guía comentada de parámetros: que fai reproducible unha exposición

O recurso orixinal desta páxina é unha lista de comprobación. Calquera exposición á luz dun estudo que omita estes datos non se pode comparar con outra, por moi semellante que pareza a dose destacada.

1. Lonxitude de onda e ancho de banda. Pico e largura total, non o nome dunha cor. Os LED vermellos abranguen de 630 a 680 nm, con absorcións moi distintas do colorante.
2. Irradiancia na superficie da mostra, medida, en mW por cm cadrado. A potencia en watts indicada polo fabricante non é irradiancia.
3. Duración e pulsación. Aplicación continua fronte a pulsada, incluídas a frecuencia dos pulsos e o ciclo de traballo cando corresponda.
4. Fluencia calculada a partir do par de valores medidos anterior, en J por cm cadrado.
5. Concentración, formulación e estado de agregación do colorante. O monómero preto de 664 nm fotosensibiliza de forma distinta aos agregados preto de 610 nm.
6. Intervalo entre o fármaco e a luz. De minutos a horas entre a administración do colorante e a irradiación, o que determina onde está o colorante cando chega a luz.
7. Osixenación. Unha solución aireada fronte a un tecido hipóxico cambia directamente o equilibrio entre o tipo I e o tipo II.
8. Xeometría. Profundidade da mostra, volume, tipo de recipiente, distancia e ángulo da fonte, e profundidade do tecido diana.

Un hábito útil ao ler artigos científicos: comprobar primeiro o intervalo entre o fármaco e a luz. Revela a intención. Os deseños fotodinámicos irradian deliberadamente tecido que contén colorante. Os deseños combinados poden separar os dous a propósito, como se describe a continuación.

A fotobiomodulación con infravermello próximo non é fotoactivación do colorante

A fotobiomodulación, normalmente abreviada como PBM, emprega luz vermella ou infravermella próxima para modular a sinalización endóxena sen engadir un fotosensibilizador. A terapia fotodinámica, normalmente abreviada como PDT, emprega tres compoñentes xuntos: luz que o sensibilizador absorbe, o propio sensibilizador e osíxeno para crear unha descarga de especies reactivas que dana a diana. Unha revisión das mitocondrias como diana de neuroprotección combina o azul de metileno coa PBM porque converxen na respiración desde vías distintas: o colorante actúa como un axente catalítico de ciclos redox que favorece o fluxo de electróns, mentres que se formula a hipótese de que a PBM promove a disociación do óxido nítrico inhibidor da citocromo c oxidase no complexo IV. Ese mecanismo enzimático debe seguir identificado como unha hipótese.

Os dous estudos de combinación en ratos máis citados empregan luz de 810 nm, que é precisamente a razón pola que non demostran a fotoactivación do colorante. Nun estudo de pretratamento ante a privación do sono, os ratos recibiron azul de metileno diario a 0.5 mg por kg, láser pulsado de 810 nm en días alternos, ou ambos antes da privación. O pretratamento combinado protexeu as condutas relacionadas coa memoria e as proteínas sinápticas do hipocampo, mentres que os tratamentos por separado fracasaron en gran medida. Nun estudo de estrés crónico con tratamento concomitante, os ratos recibiron PBM de 810 nm a 8 J por cm cadrado xunto con colorante diario a 0.5 mg por kg; o láser aplicouse primeiro e o colorante inxectouse dúas horas despois, especificamente para evitar irradiar tecido que contivese colorante. Os tres grupos reverteron os déficits de aprendizaxe, cun beneficio aditivo principalmente no cortisol sérico e nas especies reactivas de osíxeno no cerebro. Estes resultados avalían dúas intervencións mitocondriais empregadas conxuntamente, unha distinción que a colección de estudos fotodinámicos mantén visible ao rexistrar a lonxitude de onda para cada indicación.

A evidencia sobre a pel sitúase no outro lado. Os datos en humanos sobre azul de metileno máis luz na pel concéntranse entre 630 e 680 nm, con colorante tópico ou intralesional e intención destrutiva ou de remodelación, o que é PDT por definición. Citar esa eliminación como proba de que o colorante potencia a PBM, ou citar unha recuperación en ratos a 810 nm como proba de que un panel de 660 nm máis colorante constitúe un protocolo para a cognición, confunde os réximes. A referencia sobre dosificación e farmacoloxía e a guía de seguridade e interaccións desenvolven máis as partes desta cuestión relativas á concentración e ás contraindicacións.

Identifique o concepto antes de comparar números. A lonxitude de onda determina se o colorante absorbe. A irradiancia e a duración determinan o que fai a química con esa absorción. A xeometría determina que parte da mostra experimenta algo diso. Dúas exposicións que coinciden nun parámetro e difiren nos demais son experimentos distintos, e tratalas como intercambiables é o erro que esta guía pretende evitar. De nada disto se deriva un protocolo doméstico; a luz cunha lonxitude de onda compatible xunto cun colorante sistémico converte unha exposición que doutro xeito sería moduladora en fotoquímica impulsada por un fotosensibilizador, que debe quedar en mans de profesionais clínicos.