As tinguiduras con azul de metileno alcalino de Loeffler e policromático, explicadas

Nunha bancada de tinguidura pode haber tres frascos un ao lado do outro, cada un etiquetado cunha variante do azul de metileno. Un di azul de metileno acuoso 1%. Outro di azul de metileno alcalino de Loeffler. Outro di azul de metileno policromático. Un traballador con présa colle o que ten máis preto. O frotis queda entón tinguido con pouca intensidade, cun azul demasiado uniforme ou con tons púrpura inesperados, e a culpa do resultado atribúese á mostra.

É un problema de formulación, non da mostra. As tres solucións conteñen corantes relacionados, pero responden a conceptos de tinguidura diferentes. Unha é un corante catiónico simple cun pH próximo ao neutro. Outra é o mesmo corante, cuxa acción se intensifica mediante un álcali. A terceira xa non é un único corante, senón unha mestura oxidada deliberadamente. Se se usa a incorrecta, o principio de tinguidura cambia nas súas mans.

A resposta breve

O azul de metileno acuoso simple é o punto de partida: arredor dun 1% de corante en auga, un corante catiónico simple para a morfoloxía bacteriana e a microscopía xeral. O azul de metileno alcalino de Loeffler engade unha pequena cantidade medida de álcali diluído a unha solución nai alcohólica diluída en auga, o que eleva o pH e intensifica a unión do corante catiónico ás estruturas bacterianas ácidas. O azul de metileno policromático é azul de metileno sometido deliberadamente a maduración por oxidación nun medio alcalino, de modo que o frasco contén unha mestura de homólogos desmetilados (azure A, azure B, azure C), tionina e violeta de metileno, xunto con azul de metileno residual, e esa mestura tingue distintas estruturas con tonalidades diferentes.

Se só lembra unha frase: a alcalinización cambia a intensidade da tinguidura, mentres que a policromatización cambia as cores da tinguidura.

Azul de metileno acuoso común: o punto de referencia

A formulación máis simple é azul de metileno disolto en auga, habitualmente ao 1% w/v, sen álcali e sen oxidación. A especie coloreada é o catión metiltioninio cun contraión cloruro, un pequeno corante fenotiazínico plano descrito na ficha do azul de metileno de PubChem como cloruro de metiltioninio. Como catión, únese aos esqueletos de fosfato dos ácidos nucleicos e aos grupos ácidos das paredes celulares bacterianas, e colorea as células de azul sobre un fondo claro.

A súa virtude é a previsibilidade. Os núcleos e as bacterias aparecen azuis. O contraste é moderado. Os microorganismos pouco visibles poden tinguirse debilmente, que é precisamente a limitación que Loeffler se propuxo resolver. Para coñecer a familia máis ampla de tinguiduras bacterianas simples á que pertence esta solución, consulte unha visión xeral da tinguidura bacteriana simple. Aquí tamén importa identificar con rigor o corante: o azul de metilo é unha molécula completamente distinta, como explica azul de metilo fronte ao azul de metileno, polo que unha busca nun catálogo baseada só no nome da cor pode levar a unha clase de corante incorrecta.

Azul de metileno alcalino de Loeffler: o mesmo corante, cunha acción máis intensa

A receita clásica de Loeffler combina unha solución nai alcohólica de azul de metileno con álcali diluído en auga. As versións dos manuais indican 0.3 g de corante en 30 mL de etanol ao 95% máis 100 mL de hidróxido de potasio acuoso ao 0.01% (ou, de forma equivalente, 30 mL de azul de metileno alcohólico saturado, 100 mL de auga destilada e 1 mL de KOH ao 1%), o que dá unha solución de traballo cunha concentración de corante próxima ao 0.3% e un pH claramente alcalino. As versións comerciais seguen o mesmo principio, e o catálogo de corantes de microbioloxía de Thermo Fisher inclúe o azul de metileno alcalino de Loeffler xunto coas variantes policromática e acuosa como artigos de catálogo separados con usos previstos diferentes.

O álcali é o elemento clave. Ao elevar o pH, desprotonanse os grupos carboxilo e fosfato da mostra, o que aumenta a densidade de sitios negativos, mentres que a solución nai de etanol mantén o corante completamente disolto para que chegue a eses sitios en forma monomérica. O resultado é unha tinguidura das bacterias máis rápida e intensa que a obtida co corante acuoso neutro, cos característicos bacilos e cocos de azul intenso dun frotis bacteriolóxico de rutina. O tempo de tinguidura adoita ser de un a tres minutos, seguido dun enxaugado con auga.

A aplicación clásica é Corynebacterium diphtheriae cultivado no medio de soro de Loeffler: bacilos delgados, a miúdo con forma de maza, con gránulos metacromáticos de Babes-Ernst de polifosfato almacenado intensamente tinguidos. A asociación do medio e do corante é histórica, ambos atribuídos ao mesmo bacteriólogo, e o contraste dos gránulos é a vantaxe diagnóstica. Ademais do traballo coa difteria, o corante serve como corante bacteriolóxico xeral para frotis de cultivos, para a morfoloxía de Neisseria en frotis clínicos e para calquera situación na que non sexa necesaria unha tinguidura de Gram pero o azul acuoso simple resulte demasiado tenue. É unha tinguidura monocromática. Todo o que é ácido adquire algún ton de azul. Cando un protocolo require unha cor diferencial, o álcali por si só non pode proporcionarla.

Unha precaución práctica: as solucións alcalinas de corantes deterióranse e forman precipitados co almacenamento e a absorción de dióxido de carbono. Os laboratorios preparan volumes moderados ou compran a solución de catálogo e respectan a súa vida útil, en lugar de seguir aproveitando un frasco vello que xa deposita sedimento en cada portaobxectos.

Azul de metileno policromático: un nome, varios corantes

O azul de metileno policromático parte do mesmo corante, pero sométeo a unha oxidación controlada nun medio alcalino, chamada historicamente maduración ou policromatización. O envellecemento alcalino, o quecemento con carbonato ou a oxidación con axentes como o dicromato eliminan progresivamente grupos metilo dos substituíntes dimetilamino. O produto é unha mestura: azul de metileno residual máis azure B (cun grupo metilo menos), azure A e azure C (cunha desmetilación adicional), tionina (completamente desmetilada) e produtos secundarios da oxidación da familia do violeta de metileno. Cada compoñente ten a súa propia tonalidade e afinidade polos tecidos, polo que a mestura tingue de forma metacromática: os núcleos, os gránulos, as mucinas e a cartilaxe adquiren tons distintos que van do azul ao vermello púrpura.

Esta química é a mesma que está detrás das famosas tinguiduras de sangue. Os primeiros investigadores descubriron que o azul de metileno alcalinizado tinguía os núcleos dos parasitos da malaria en tons púrpura, pero as súas solucións acuosas maduradas eran inestables e formaban precipitados en poucos días. A revisión sobre como se inventou a tinguidura púrpura de sangue describe como Malachowski e Romanowsky aproveitaron este efecto de forma independente en 1891, como se introduciu o metanol para estabilizar o precipitado do corante e fixar os frotis sen calor, e como Giemsa estandarizou máis tarde a mestura con cantidades medidas de azure B e eosina, estabilizadas con glicerol. As tinguiduras modernas de tipo Giemsa derivan directamente do azul de metileno policromático combinado con eosina, a combinación que produce o efecto Romanowsky. Para coñecer en detalle a combinación con eosina e o compoñente azure B, consulte tinguiduras de tipo Romanowsky e a interacción entre azure B e eosina.

Ao ser unha mestura, o azul de metileno policromático é, pola súa propia natureza, o menos estandarizado dos tres. O seu equilibrio exacto de tonalidades depende da vía de oxidación e do seu grao, polo que os provedores de histoloxía o venden como un produto distinto, coas súas propias probas de rendemento, e non como unha solución de Loeffler envellecida. Os usos habituais inclúen a visualización metacromática dos gránulos dos mastocitos, das mucinas e da cartilaxe, dos detalles das células plasmáticas e de Helicobacter pylori en cortes de tecido mediante métodos policromáticos de tipo Goodpasture. É a opción correcta cando se busca a diferenciación pola cor, e a incorrecta cando o protocolo espera unha silueta bacteriana monocromática nítida.

Comparación das formulacións e das finalidades

Lea a táboa como un procedemento para tomar decisións. Se a mostra se tingue con demasiada pouca intensidade, cambie o enfoque do pH e escolla o de Loeffler. Se todo se tingue pero nada se distingue, cambie o enfoque do corante e escolla o policromático. Se un frotis tinguido con Loeffler mostra os gránulos con gran claridade pero o supervisor pregunta por que os núcleos e o citoplasma comparten un mesmo azul, a resposta é que ningún corante alcalino monocromático pode facer ese traballo. Esa cuestión corresponde á familia policromática e aos seus derivados para a tinguidura de sangue.

Como evitar as confusións habituais

Dous erros explican a maior parte da confusión. O primeiro é considerar que o de Loeffler é intercambiable co azul de metileno simple porque ambos parecen azuis no frasco. Difiren no pH e na intensidade, e substituír por un corante neutro o de Loeffler cando este está especificado fai perder precisamente o contraste dos gránulos arredor do cal se deseñou o protocolo. O segundo é considerar policromático calquera azul alcalino vello ou envellecido accidentalmente. O envellecemento non controlado produce unha mestura descoñecida cunha concentración descoñecida, mentres que as verdadeiras solucións policromáticas se preparan mediante vías de oxidación definidas e, na liñaxe das tinguiduras de sangue, se combinan con cantidades medidas de eosina. A historia resulta instrutiva aquí: as solucións acuosas maduradas e inestables da década de 1890 deron paso a formulacións metanólicas estabilizadas precisamente porque as mesturas non controladas non se podían reproducir, unha lección que convén lembrar antes de tinguir un portaobxectos diagnóstico cun frasco de antigüidade incerta.

O rigor nos nomes completa o proceso. Confirme na etiqueta o artigo do catálogo (acuoso, de Loeffler ou policromático), o contido de corante e a aplicación prevista, en lugar de deducilos pola cor. As tres formulacións comparten unha orixe cromófora. Non comparten unha finalidade.