Royndirnar, sum knýttu metylenblátt at kyknuanding

Mannablóð, har fibrinið er tikið burtur, brúkar umleið tvey prosent av súrevninum, sum tað inniheldur, tá ið tað verður hildið við 37 °C í tríggjar tímar. Verður ein lítil nøgd av metylenbláum latin í undan inkubatiónini, brúkar sama blóð umleið sekstifimm prosent. Einki við sjálvum kyknunum broyttist. Bert loysnin broyttist.

Hetta talið stavar frá eini grein frá 1928 eftir George Harrop og E. S. Guzman Barron á Johns Hopkins. Tað er upprunin til nógv endurtikna pástandin um, at metylenblátt betrar kyknuandingina. Pástandurin er ikki skeivur, men merkir minni, enn hann ljóðar sum.

Hvat talið í talvuni veruliga mátar

Mátaða úrslitið var súrevnisupptøka, ásett við gassgreining. Harrop og Barron síaðu nýliga tikið blóð gjøgnum bummull við 10 °C fyri at taka hvítu blóðkyknurnar burtur, mettaðu sýnið við súrevni, býttu tað í tvey, lótu litevni í annan partin og greinaðu báðar eftir inkubatión. Talið av hvítum blóðkyknum fór sjáldan upp um umleið túsund fyri hvønn rúmmillimetur. Súrevnisnýtslan varð givin upp sum tann parturin av upprunaliga súrevnisinnihaldinum í sýninum, sum var horvin.

Teir máldu eisini koltvísúrni, og har gav háttalagið trupulleikar. Blóð, har fibrinið var tikið burtur, gav frá sær upp í tvær millimol av koltvísúrni fyri hvørjar 100 mL í fyrsta tímanum av inkubatiónini av orsøkum, sum ikki høvdu samband við reaktiónina, ið varð kannað. Tí kundu andingarkvotientarnir frá heilblóði ikki brúkast. Bert vaskaðar kyknur í Locke-loysn góvu tøl, sum kundu tulkast, og tey lógu millum 0.73 og 0.80 bæði við og uttan litevnið.

Hetta er ikki ein týdningarleysur smálutur. Í hesum greinum merkir „anding“ gassskifti í einum afturlatnum ílati. Munurin millum súrevnisnýtslu og framleiðslu av orku, sum kykna kann brúka, verður viðgjørdur fyri seg í hvat súrevnisnýtsla sigur og ikki sigur um ATP.

Litevnið økti mest, har kyknurnar andaðu minst

Búnar reyðar blóðkyknur hjá súgdýrum hava næstan onga mátbara súrevnisnýtslu. Reyðar blóðkyknur hjá fuglum, sum hava kyknukjarna, hava súrevnisnýtslu. Harrop og Barron kannaðu bæði sløgini, og munurin millum tey er grundarlagið undir teirra niðurstøðu.

Í sýnunum frá súgdýrum økti litevnið nýtsluna tjúgu til fimmti ferðir. Í gásablóði, har kyknurnar longu andaðu, økti tað ongantíð ferðina meira enn tvífalt. Jú hægri andingin var frammanundan, tess minni kundi litevnið leggja afturat.

Sama mynstur sæst innan sama slag. Eitt mannablóðsýni frá einum sjúklingi við polycythemia vera, sum innihelt óbúnar kyknur, brúkti 11.3 prosent av súrevninum uttan litevni, samanborið við 2.8 prosent hjá vaskaðum kyknum frá einum frískum gevara. Litevnið fekk tað bert upp í 63.4 prosent, eina seksfalda øking, meðan nýtslan hjá vanligum kyknum øktist nærum tríati ferðir. Litevnið fekk búnar kyknur at bera seg meira at sum óbúnar kyknur, og tað var júst tað, høvundarnir søgdu, at tað gjørdi.

Cyanid átti at hava steðgað tí

Tað var kent, at cyanid steðgaði oxidering í kyknum. Harrop og Barron lótu tað kortini í saman við litevninum.

Úrslitini við neytablóði eru umboðandi. Súrevnisinnihaldið minkaði úr 22.61 niður í 22.03 rúmprosent eftir tríggjar tímar uttan nakað íblandað. Við metylenbláum minkaði tað niður í 12.84. Við metylenbláum og kaliumcyanidi við einum molariteti á ein fimm túsundapart minkaði tað niður í 12.74. Ávirkanin av litevninum var í høvuðsheitum óbroytt.

Mynd: ein samanhangandi mikroandingarmáting av reyðum blóðkyknum hjá menniskjum. Pílurin vísir, nær metylenblátt verður latið í. Frammanundan er kurvan næstan fløt; aftaná hækkar hon javnt. Endurgivin úr Harrop og Barron, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

Niðurstøðan hjá teimum var, at litevnið virkaði sum súrevnisberi og „útvegaði eitt evni, sum er horvið úr kjarnaleysum reyðum blóðkyknum hjá vaksnum súgdýrum.“ Tvey ár seinni orðaðu Michaelis og Salomon á Rockefeller Institute ósemjuna soleiðis, sum hon síðani hevur staðið. Antin var ávirkanin av litevninum „ein tilvildarligur eginleiki hjá litevninum“, ella var litevnið „ein fyrimynd fyri eitthvørt ókent evni í lívverunum“. Hesir báðir møguleikarnir eru framvegis ikki endaliga avgreiddir. Tað, sum er broytt, er, at kyknurnar nú kunnu lýsast nógv neyvari.

Ein útdráttur úr livur gjørdi tað sama

Michaelis og Salomon vístu, at útdrættir úr gøgnum, gjørdir við køldum vatni, elva til somu stimbraðu nýtslu. Rottulivur hevði sterkastu ávirkanina, síðani nýra, milt og eista. Heili, vøddar og blóðserum høvdu lítla ella onga ávirkan.

Síðani kannaðu teir útdráttin við kolmonoxidi. Anding, sum annaðhvørt útdrátturin ella litevnið hevði sett í gongd, var óbroytt í eini blanding av 98 prosentum kolmonoxidi og 2 prosentum súrevni. Sama gassblanding tálmaði andingini hjá geri og hjá reyðum blóðkyknum við kjarna frá høsnafuglum við umleið 60 til 80 prosentum, í samsvari við lýsing Warburgs av einum andingarensými, sum er viðkvæmt fyri kolmonoxidi. Ókenda evnið í vevnaðinum var tí ikki ensýmið hjá Warburg.

Fleiri uppskot um, hvat evnið kundi vera, vórðu vrakað á leiðini. Reducerað glutathion og cystein elvdu bert til ta súrevnisnýtslu, sum teirra egna oxidering kravdi. Koensýmið hjá Harden og Young varð útilokað, tí vøddar innihalda mest av tí og vístu næstan minstu ávirkanina. Cytokromið hjá Keilin, sum hevði fingið navn fá ár frammanundan, rann seg í somu mótsøgn. Teirra egna uppskot, at virkna evnið kom úr kyknukjarnanum, kallaðu teir bert eitt uppskot.

Ávirkanin kravdi ávísar umstøður

Kyknurnar máttu vera heilar. Hemolysa við destilleraðum vatni ella endurtikinari frysting tók viðbragdið móti bæði litevninum og útdráttinum burtur, og lutvís hemolysa minkaði tað samsvarandi.

Sukur var eisini neyðugt. Glukosa, fruktosa og sukrosa stuðlaðu andingini, sum litevnið elvdi til; mannitol gjørdi tað ikki. Uttan sukur var eingin anding yvirhøvur, og litevnið tóktist skaða kyknurnar í tilgongdini. Tí fekk glukosa, sum varð latin í ein ella tveir tímar seinni, ikki andingina í gongd aftur. Høvundarnir skutu upp, at litevnið oxideraði ein bygnaðarpart, sum kyknan hevði tørv á.

Ljós økti munandi ávirkanina av litevninum, hóast ávirkanin eisini var týðilig í myrkri. Onnur litevni, sum kunnu reducerast, bóru seg øðrvísi at: toluylénblátt hevði somu ella størri ávirkan enn metylenblátt, meðan indigodisulfonat næstan einki gjørdi. Einki greitt samband sást millum oxideringar- og reduktiónspotentialið hjá einum litevni og styrkina á ávirkanini. Høvundarnir settu hetta í samband við gjøgnumtreingiligheitina hjá kyknuhinnuni og eiturvirkni.

Ávirkanin fylgdi geringini, ikki andingini

Kanning Barrons frá 1930 fór frá kyknususpensiónum til vevnaðarskurðir úr vanligum rottugøgnum og ígræddum æxlum.

Í vevnaði uttan aeroba glykolysu gjørdi metylenblátt einki ella tálmaði súrevnisnýtsluna eitt sindur: í nýra við umleið 14 prosentum, í brisi við umleið 14 prosentum og í livur við umleið 5 prosentum. Í vevnaði, sum gerjaði hóast súrevni, økti tað nýtsluna: í milt við umleið 8 prosentum og í heila við umleið 13 prosentum. Í æxlum var økingin frá umleið 27 prosentum í einum bróstkarcinomi frá menniskja til meira enn 80 prosent í einum Rous-sarkomi frá hønu, umleið í lutfalli við aerobu glykolysuna hjá hvørjum vevnaði.

Mynd: hvørt punkt er eitt vevnaðarslag. Vatnrætti ásurin vísir aeroba glykolysu; loddrætti ásurin vísir broytingina í súrevnisnýtslu eftir metylenblátt. Dátur úr Barron, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), talva 6, PMID 19869777.

Cyanidroyndin gav síðani ta øvutu myndina. Tá ið andingin í vevnaðinum, sum áður ikki hevði reagerað, varð steðgað við cyanidi og geringin kom fram, økti litevnið aftur súrevnisnýtsluna: í nýra við umleið 59 prosentum, í livur við umleið 19 prosentum, í milt við umleið 286 prosentum og í eista við umleið 200 prosentum.

Barron skeyt upp, at litevnið kundi brúkast sum ein roynd av geringarførleikunum hjá eini kyknu ella einum vevnaði. Hann endaði við eini hugsan: fleiri ættarlið av æxlisdyrking í einum miðli við litevni kundu kanska einaferð fáa evnaskiftið í einum æxli at líkjast tí í vanligum vevnaði varandi. Hetta var ein granskingarspurningur, skrivaður í 1930. Tað er ikki ein pástandur um viðgerð.

Hvat royndirnar ikki kunnu hava mált

Í 1928 og 1930 merkti „anding“ súrevnisnýtslu. Adenosintrifosfat varð fyrstu ferð lýst í 1929, og prógvið fyri, at avbyrgd mitokondriur esterifisera fosfat, meðan tey flyta elektronir, kom í 1949. Eingin av fyrstu greinunum um metylenblátt kann hava mált orkuframleiðslu, og eingin teirra segði seg hava gjørt tað.

Kyknurnar eru hin trupulleikin. Búnar reyðar blóðkyknur hjá súgdýrum innihalda eingi mitokondriur. Á retikulocytstiginum beina tær mitokondriur og ribosom burtur við selektivari autofagi. Tí fær ein búgvin reyð blóðkykna orku frá glykolysu og er bundin at pentosufosfatleiðini fyrst og fremst fyri at fáa NADPH heldur enn ATP. Í royndunum frá 1928 var eingin elektronflutningsketa til staðar, sum kundi umvælast. Tað, sum brúkti súrevnið, gjørdi okkurt annað.

Hvat hetta annað var, er nú rímiliga væl lýst. Metylenblátt tekur ímóti elektronum frá reducerandi evnum í kyknuni og verður til leukometylenblátt, sum molekyler súrevni oxiderar aftur, so ringrásin verður lokað. Í reyðum blóðkyknum hjá menniskjum fremja NADPH-bundin flavinreduktasa og skyldar disulfidreduktasur reduktiónsstigið. Ein kanning frá 1976 við merktari glukosu vísti, at litevnið stimbrar hexosumonofosfatleiðina, at ávirkanin við lágum styrki var bundin at oxyhemoglobini, og at ein hægri styrkur, 0.1 mM, framleiddi vetnisperoxid. Eitt reducerað litevni, sum møtir súrevni, framleiðir peroxid, ikki fosfatbindingar.

Í mitokondrium er myndin meira umstrídd, enn vanligu samandráttirnir geva til kennar. Ein granskingarleið heldur, at litevnið tekur elektronir úr økinum við kompleks I og letur tær til cytokrom c. Ein onnur vísti, at tað í mitokondrium úr músarheila ikki kann fáa andingina í gongd aftur eftir eina antimycinblokering, og staðsetti í staðin elektronmóttakaran við ubiquinolbindingsstaðið á kompleks III. Ein triðja vísti, at lágir styrkir øktu súrevnisnýtsluna í hvíld, meðan ADP-stimbraða andingin var óbroytt. Tann beinleiðis niðurstøðan er, at súrevnisnýtsla, sum metylenblátt elvir til, als ikki er bundin at oxidativari fosforylering: hon helt fram, tá ið andingarketan varð tálmað, og í fyrireikaðum sýnum uttan eina slíka ketu.

Beinleiðis mátingar av muninum millum hesar báðar støddirnar eru eisini til. Í avbyrgdum mitokondrium úr rottulivur minkaðu vaksandi styrkir av litevni andingareftirlitslutføllini og elvdu til svelling. Høvundarnir lýstu hetta sum avkopling av oxidativari fosforylering. Í gjøgnumfløddari rottulivur økti metylenblátt súrevnisnýtsluna, meðan ATP-ADP-lutfallið minkaði.

Kliniska tilfarið gevur sama boðskap. Methemoglobinemi verður viðgjørd við umleið einum til tveimum milligrammum av metylenbláum fyri hvørt kilogramm, givið í æðr, gjøgnum eina NADPH-bundna reduktiónsleið, og størri skamtar elva til ta støðu, sum verður viðgjørd. Sama yvirlit vísir á, at móteitursávirkanin er størst í heilum reyðum blóðkyknum og minni, tá ið hemolysa er til staðar. Hetta er úrslitið um hemolysu frá 1930, sum kemur aftur sjeyti og trý ár seinni í sjúkrahøpi. Eitt evni, har gagnligar og skaðiligar ávirkanir liggja hvør sínu megin eitt skamtamark, er ikki eitt evni, har skamturin eigur at verða ásettur út frá eini máting av súrevnisnýtslu.

Hví framleiðsluparturin hoyrir við í viðgerðina av evninum

Harrop og Barron løgdu merki til nakað, sum er vert at lesa einaferð afturat. Metylenblátt sjálvt gevur eitt band í spektroskopinum millum tey bæði eyðkendu bondini hjá methemoglobini, „sum lætt kann elva til samanblanding við eina leysliga kanning“. Litevnið kann líkjast evninum, sum leitað verður eftir.

Sami trupulleiki hevur eina kemiska síðu. Eitt skylt fenotiazin, sum er til staðar sum ein lítil partur av innihaldinum, hevur sína egnu redoxatferð, sína egnu gjøgnumtreingiligheit og sítt egna eiturvirkni. Eitt skjalprógvað dømi ger týdningin ítøkiligan: í eini kanning av jodering av metylenbláum góvu sýni við umleið 7 til 8 prosentum Azure B fyrst og fremst joderað Azure B. Tí var tað óreinskan heldur enn metylenblátt, sum ráddi í reaktiónini.

Tann, sum brúkar metylenblátt sum reagens á eini starvsstovu, við eitt litingarborð ella í einum akvariumi, arbeiðir við einum evni við ótilskilaðum innihaldi, um framleiðsluparturin ikki er eyðkendur. Skyld evni, samleiki, grundevnisóreinskur, loysnarevnisleivdir og leivdir eftir gløðing eru ein partur av royndini heldur enn pappírsarbeiði rundan um hana. Blupreme fær sítt metylenblátt frá einum heilivágsframleiðara og almannakunnger eitt fullfíggjað greiningarváttanarskjal, har øll USP-kravlýsingin verður roynd heldur enn bert tungmetal. Vegleiðingin til at lesa eitt greiningarváttanarskjal og hvat heitið USP-góðska staðfestir og ikki staðfestir greiða frá, hvussu skjalið kann kannast í mun til pástandin.

Talið var rætt

Royndirnar frá 1928 og 1930 vórðu gjørdar við nærlagni, og høvuðseygleiðingin hevur staðið við: eitt litevni, sum kann reducerast, kann fáa eina kyknu, sum næstan ikki andar, at brúka súrevni við eini ferð, sum er mangar ferðir hægri enn í hvíld, uttan at fara gjøgnum tað stigið, sum cyanid steðgar.

Mistakið kemur seinni, tá ið „anding“ verður lisið við nútíðarmerkingini. Ein máting av gassskifti sigur, at elektronir komu fram til súrevni. Hon sigur ikki, at nakrar teirra vórðu brúktar til at framleiða ATP, og í eini kyknu uttan mitokondriur er munurin millum hesar báðar útsagnirnar so stórur, sum hann kann verða. Breiðara yvirlitið yvir, hvat metylenblátt ger í kyknum setur sama mun í ein størri samanhang, og søgan um evnið frá litevni til heilivág greiðir frá, hvussu eitt vevnaðarlitevni yvirhøvur kom at verða brúkt í hesum royndum.