Voiko metyleenisininen ohittaa mitokondrioiden kompleksin III? Miksi tutkimukset ovat eri mieltä

Kaksi laboratoriota selvitti, voiko metyleenisininen ohittaa estetyn mitokondrioiden kompleksin III. Toinen vastasi ei. Toinen vastasi kyllä. Molemmilla oli tutkimusaineistoa.

Ensimmäisessä tutkimuksessa hiiren aivojen mitokondrioilla havaittiin, ettei väriaine pysty siihen. Toisessa tutkimuksessa kolmen jyrsijälajin aivojen mitokondrioilla havaittiin, että se pystyy siihen osittain. Kolmas, hiiren maksalla tehty tutkimus mainitaan usein samassa yhteydessä, mutta siinä tutkittiin jotain muuta. Kun sen pitää oikeassa asiayhteydessä, puolet epäselvyydestä poistuu.

Yleispätevää mekanismia ei voida julistaa. On kolme koetta, joissa käytettiin eri estäjiä, annoksia ja mittauksia. Lue ensin koeolosuhteet. Johtopäätökset seuraavat niistä.

Mitä ohitus tässä tarkoittaa

Elektronit tulevat ketjuun kompleksin I kautta (NADH:sta) tai kompleksin II kautta (sukkinaatista), kulkevat kompleksin III kautta sytokromi c:lle ja sitten kompleksin IV kautta hapelle. Matkan varrella muodostuva gradientti on se, mitä solu käyttää ATP:n tuottamiseen.

Ohitusväitteen mukaan metyleenisininen vastaanottaa elektroneja ennen estokohtaa ja luovuttaa ne sen jälkeen. Hapettunut väriaine ottaa elektroneja NADH:lta tai ketjun alkupään komponenteilta ja muuttuu leukometyleenisiniseksi, ja pelkistynyt muoto luovuttaa ne sytokromi c:lle tai takaisin ketjuun. Jos luovutus tapahtuu estokohdan jälkeen, hengitys ja kalvopotentiaali palautuvat osittain. Jos se tapahtuu estokohdassa tai sitä ennen, kumpikaan ei palaudu.

Yksi kompleksin III yksityiskohta ratkaisee suuren osan tästä kiistasta. Kompleksi toimii Q-syklin avulla, ja siinä on kaksi estäjien sitoutumiskohtaa. Antimysiini sitoutuu Qi-kohtaan. Myksotiatsoli sitoutuu Qo-kohtaan. Tutkimus, jossa käytetään vain toista niistä, on testannut vain puolet kompleksista.

Ensimmäinen tutkimus: ei ohitusta hiiren aivojen mitokondrioissa

Gureev ja kollegat käyttivät C57BL/6-hiirten aivokuoren mitokondrioita, jotka eristettiin digitoniinilla ja tutkittiin pitoisuudessa 0.1 mg proteiinia millilitraa kohti. Substraatteja käytettiin kolmessa yhdistelmässä: pyruvaattia ja malaattia kumpaakin 5 mM, sukkinaattia 10 mM yhdessä 2 mM glutamaatin kanssa sekä L-proliinia 10 mM. Estäjinä olivat rotenoni pitoisuudessa 1 mikromolaarinen (kompleksi I) ja antimysiini pitoisuudessa 1 mikrogramma millilitraa kohti (kompleksi III). Väriaineen annokset olivat 0.5, 1 ja 2 mikromolaarisia, ja pääasiallinen pitoisuus oli 1 mikromolaarinen. Menetelmät ja mittauskäyrät ovat FEBS Letters -julkaisussa.

Kompleksin I ohitus toimi. Rotenoni vähensi ADP:n stimuloimaa hengitystä noin 121:stä noin 2 nmol:iin minuutissa mg:aa kohti, ja 1 mikromolaarinen väriaine palautti sen noin 21:een. Kalvopotentiaali palautui pyruvaatin ja malaatin yhdistelmällä sekä L-proliinilla.

Kompleksin III ohitus ei toiminut. Antimysiini vähensi hengityksen noin 16:een, ja väriaine nosti sen vain noin 20:een. Kalvopotentiaali ei palautunut millään substraatilla edes 5 mikromolaarisilla väriaineannoksilla. Peroksidimittaukset osoittivat samaan suuntaan: pelkkä väriaine nosti peroksidin vapautumisen perustasolta, joka oli noin 76 pmol minuutissa mg:aa kohti, suunnilleen tasoille 1170, 1460 ja 1945 kolmella annoksella. Antimysiini kuitenkin vähensi tätä väriaineen synnyttämää signaalia vastaavasti noin 25, 88 ja 96 prosenttia. Jos pelkistynyt väriaine reagoisi suoraan hapen kanssa, kompleksin III estämisen ei pitäisi vaimentaa signaalia. Kirjoittajat päättelivät, että pelkistynyt väriaine hapettuu kompleksin III Qo-kohdassa ennen antimysiinin estokohtaa. Lyhyt kierto sanallisesti: luovuttajilta väriaineelle, väriaineelta Qo-kohtaan, siitä eteenpäin normaalia reittiä. Rotenoni ohitetaan. Antimysiiniä ei.

Toinen tutkimus: osittainen ohitus kolmessa lajissa kummassakin estokohdassa

Svab ja kollegat laajensivat koeasetelmaa. Hiirten, rottien ja marsujen aivojen mitokondriot eristettiin Percoll-menetelmällä ja tutkittiin samassa pitoisuudessa, 0.1 mg millilitraa kohti. Substraatteina käytettiin pyruvaattia ja malaattia tai glutamaattia ja malaattia, kutakin 5 mM. He käyttivät kahta kompleksin III estäjää: antimysiini A:ta pitoisuudessa 0.3 mikromolaarinen ja myksotiatsolia pitoisuudessa 1 mikromolaarinen. Väriaineen pitoisuus oli useimmissa määrityksissä 2 mikromolaarinen ja sytokromi c -kokeissa 0.5. Kaikkien kolmen lajin yhtenäisin menetelmin tehdyt kokeet esitetään avoimesti saatavilla olevassa artikkelissa.

Molemmat estot ohitettiin osittain kaikissa kolmessa lajissa. Hiiren mitokondrioissa antimysiini vähensi hengitystä, ja väriaine lisäsi sitä noin 60 prosenttia, suunnilleen 37:stä 59 nmol:iin minuutissa mg:aa kohti. Myksotiatsoli vähensi sitä 88 prosenttia, noin 4.5:een, ja väriaine nosti sen viisinkertaiseksi, noin 23:een. Kalvopotentiaali repolarisoitui osittain kummankin estäjän läsnä ollessa. Se mitattiin kahdella väriaineella (safraniini O ja ratiometrinen TMRM) optisten artefaktien poissulkemiseksi.

Tässä tutkimuksessa testattiin myös elektronien luovutusta suoraan, mitä ensimmäisessä tutkimuksessa ei tehty. Ulkoisesti lisätty asetyloitu sytokromi c pitoisuudessa 25 mikromolaarinen ei pelkistynyt energisoitujen mitokondrioiden vaikutuksesta estäjien kanssa eikä ilman niitä, mutta väriaineen lisääminen käynnisti pelkistymisen kummassakin tapauksessa. Soluttomassa puskuriliuoksessa NADH ja väriaine pelkistivät sytokromi c:tä nopeudella, joka oli verrannollinen NADH:n määrään. Pidempi hyppy sanallisesti: pelkistysekvivalentit väriaineelle, väriaineelta suoraan sytokromi c:lle, kompleksin IV kautta hapelle. Tämä reitti ohittaa kompleksin III kokonaan, joten kumpikin esto voidaan ohittaa.

Kaksi muuta mittausta tukevat tätä tulkintaa. NAD(P)H:n fluoresenssi väheni, kun väriainetta lisättiin myksotiatsolilla käsiteltyihin mitokondrioihin. Tämä tarkoittaa, että pelkistysekvivalentteja kului uuden reitin kautta. Lisäksi väriaineen absorbanssi aallonpituudella 660 nm seurasi kutakin lisäystä vuorollaan. Sentrifugoidut supernatantit osoittivat, että hapettuneen väriaineen pitoisuus kasvoi energisoitujen mitokondrioiden sisällä yli satakertaiseksi ja että väriaine poistui niistä potentiaalin romahtaessa. Myös protonitalous sopii kuvaan: pumppausvaiheiden ohittaminen jättää jäljelle noin 2 protonia elektroniparia kohti 10:n sijaan. Nopeampi hapenkulutus ja vain osittainen repolarisaatio ovat siis todellisen ohituksen tunnusmerkkejä, eivät näyttöä sitä vastaan.

Sama mitokondriovalmiste tuotti vasteita, jotka tekevät huolimattomasta tulkinnasta vaarallista. Estäjän ja väriaineen läsnä ollessa ADP vähensi hengitystä sen sijaan, että olisi lisännyt sitä, ja kuljetuksen estäminen stimuloi hengitystä sen sijaan, että olisi hidastanut sitä. Kalvopotentiaali muuttui silti tavanomaisiin suuntiin. Pelkkä hapenkulutus johtaa tässä järjestelmässä harhaan.

Kolmas tutkimus: maksatutkimus, jossa testattiin komplekseja I ja II, ei kompleksia III

Lee ja Boelsterli käyttivät hiiren maksan mitokondrioita ja viljeltyjä maksasoluja, joita vaurioitettiin efavirentsilla (kompleksi I, IC50 noin 30 mikromolaarinen) ja hydratsiinilla, isoniatsidin metaboliitilla (kompleksi II, IC50 noin 30 mikromolaarinen). Noin 30 mikromolaarinen väriaine palautti NADH:n hapettumisen, kalvopotentiaalin ja ATP:n sekä vähensi hapettavia yhdisteitä ja nekroottista solukuolemaa. Redox Biology -artikkelissa tätä mallinnetaan siten, että väriaine kuljettaa elektroneja vaurioituneiden kompleksien I ja II ohi.

Tämä tulos on vahvistettua taustatietoa ketjun alkupäästä. Se ei kerro mitään kompleksista III, koska sen toimintaa ei tutkimuksessa estetty. Se ei voi vahvistaa eikä kumota kumpaakaan aivotutkimusta.

Koeolosuhteiden vertailutaulukko

Neljä syytä, miksi molemmat kompleksin III tutkimukset voivat olla oikeassa omasta koeasetelmastaan

1. Estäjät eivät olleet sama käsittely. Pelkkä antimysiini pitoisuudessa 1 mikrogramma millilitraa kohti verrattuna antimysiiniin pitoisuudessa 0.3 mikromolaarinen sekä erilliseen Qo-kohdan estäjään. Väriaineen reitti Qo-kohtaan epäonnistuu juuri siellä, missä suora reitti sytokromi c:lle onnistuu. Yksi kohta ei voi edustaa molempia.

2. Väriaineannos ja ajoitus erosivat. Pääasialliset pitoisuudet olivat 1 ja 2 mikromolaarisia. Kyse on redox-kierrossa toimivasta aineesta, jonka soluunotto ja suora sytokromi c:n pelkistäminen riippuvat pitoisuudesta ja ajasta. Pienet annoserot ja erilaiset mittausajankohdat voivat tuoda esiin saman verkoston eri haaroja.

3. Mitokondriovalmisteet erosivat. Digitoniinieristys ja Percoll-gradienttieristys valikoivat osittain päällekkäisiä mutta eivät identtisiä mitokondriopopulaatioita. Proteiinipitoisuus oli sama, 0.1 mg millilitraa kohti, joten se voidaan sulkea pois selittävänä muuttujana. Alapopulaatioita ja rakenteellista eheyttä ei kuitenkaan voida. Myös lajiero suljettiin pois epäiltynä syynä: toinen ryhmä toisti havaitsemansa vasteen myös hiirellä.

4. Substraattitilanne määrittää, mitä väriaine voi tehdä. Kolme substraattiyhdistelmää verrattuna NADH:hon kytkeytyviin pareihin. NADH:n saatavuus ja kalvopotentiaali määrittävät yhdessä, kuinka nopeasti väriaine pelkistyy ja mihin se jakautuu. Reitti, joka tarvitsee pelkistynyttä väriainetta hapettuneen sytokromi c:n läheisyydessä, on riippuvainen tästä valinnasta.

Miten seuraavaa ohitusväitettä kannattaa lukea

Kysy, mikä kompleksi estettiin, millä estäjällä, missä kohdassa ja millä annoksella. Kysy väriaineen pitoisuutta ja mittauksen ajankohtaa. Kysy kudosta, lajia, eristysmenetelmää, proteiinipitoisuutta ja substraattia. Kysy myös, ovatko potentiaali, hengitys, redox-tila ja suoran elektronien luovutuksen määritys keskenään yhtäpitäviä, sillä pelkkä hapenkulutus osoitti tässä useammin kuin kerran väärään suuntaan.

Rajattu yhteenveto pitää paikkansa. Väriaineen kyvystä ohittaa kompleksi I ollaan yhtä mieltä. Kompleksin III osalta hiiren mitokondrioissa ei havaita toiminnallista ohitusta, kun antimysiinin pitoisuus on 1 mikrogramma millilitraa kohti ja väriaineen pitoisuus 1 mikromolaarinen. Kolmessa lajissa taas havaitaan osittainen ohitus ja suora elektroninsiirto väriaineelta sytokromi c:lle, kun antimysiinin pitoisuus on 0.3 mikromolaarinen tai myksotiatsolin pitoisuus 1 mikromolaarinen ja väriaineen pitoisuus 2 mikromolaarinen. Nämä lauseet voivat olla yhtä aikaa totta. Kaikki laajemmat päätelmät ovat ekstrapolointia.

Aiheeseen liittyvä lisälukeminen pitää kiistanalaisen väitteen kiistattoman kemian rajoissa: miten metyleenisininen siirtää elektroneja käsittelee elektronien välitystä, kompleksin I ohituskokeet ketjun alkupään vahvistettua tapausta ja kalvopotentiaalin mittaukset ja niiden artefaktit sitä, miksi tarvittiin kaksi väriainetta. Redox-kierrossa toimivien aineiden laboratoriokäsittely puolestaan käsittelee annostelun ja ajoituksen sudenkuoppia.