Vaihtoehdot metyleenisiniselle mikroskopiassa

Yksinkertaisessa bakteerisivelyssä kristallivioletti voi korvata metyleenisinisen, kun tavoitteena on nähdä solujen muoto. Elävien solujen kohdalla parempi vaihtoehto voi olla faasikontrasti ilman värjäystä. Valinta riippuu siitä, mitä sinun täytyy havainnoida.

Oletetaan, että kaksi henkilöä tutkii samaa bakteeriviljelmää. Toinen haluaa erottaa sauvamaiset solut pyöreistä soluista. Toinen haluaa tietää, onko käsittely tappanut bakteerit. Värjäys, joka antaa ensimmäiselle henkilölle selkeän kuvan, ei välttämättä anna toiselle käyttökelpoista vastausta.

Ennen korvaavan menetelmän valintaa täydennä tämä lause: “Minun täytyy havainnoida ___ näytteessä ___, ja solujen täytyy / ei tarvitse pysyä elävinä.” Tämä lause määrittää tehtävän, joka värjäyksen on suoritettava.

Aloita näytteestä ja tutkimuskysymyksestä

Päätä ensin, täytyykö solujen pysyä elävinä, ja määritä sitten ominaisuus, jota haluat havainnoida:

Solujen täytyy pysyä elävinä: liikkeen tai muodon tarkasteluun harkitse värjäämätöntä faasikontrastia tai DIC:tä; tumallisen DNA:n tarkasteluun harkitse Hoechst 33342:ta fluoresenssilla; kalvon eheyden arviointiin valitse validoitu määritys, kuten SYTO 9 yhdessä propidiumjodidin kanssa.
Solujen ei tarvitse pysyä elävinä: bakteerien morfologiaan harkitse yksinkertaista kristalliviolettivärjäystä tai nigrosiininegatiivivärjäystä; Gram-reaktion määrittämiseen käytä täydellistä Gram-värjäysmenetelmää; kiinnitettyjen solujen tumallisen DNA:n tarkasteluun harkitse DAPI-fluoresenssia.

Vertaa tämän taulukon avulla kunkin vaihtoehdon rajoituksia. Nämä ovat menetelmävalintoja, eivät ohjeita pullojen vaihtamiseen olemassa olevassa protokollassa.

Mitä sinun täytyy havainnoida	Näyte ja laitteisto	Mahdollinen vaihtoehto	Keskeinen rajoitus
Bakteerien muoto ja järjestäytyminen	Valmistettu bakteerisively; kirkaskenttä	Yksinkertainen kristalliviolettivärjäys	Näyttää morfologian; ei määritä Gram-reaktiota tai elinkykyä.
Solujen ääriviivat tummaa taustaa vasten	Bakteriologinen valmiste; kirkaskenttä	Nigrosiininegatiivivärjäys	Valmistelulla ja formulaatiolla on merkitystä; värjäämätön solu ei välttämättä ole elävä.
Gram-reaktio	Valmistettu bakteerisively; kirkaskenttä	Täydellinen Gram-värjäysmenetelmä	Edellyttää koko reagenssisarjaa ja kontrolleja.
Liike tai muutokset elävissä soluissa	Yhteensopiva märkävalmiste; faasikontrasti tai DIC	Ei värjäystä	Edellyttää sopivaa optiikkaa; kontrasti ei tunnista tiettyä molekyyliä.
Tumallinen DNA	Kiinnitetyt solut; fluoresenssi	DAPI	Edellyttää yhteensopivia viritys- ja emissiosuodattimia.
Tumallinen DNA elävissä soluissa	Elävät solut; fluoresenssi	Hoechst 33342	Soluun pääsy ei osoita, että kuvantamisolosuhteet olisivat haitattomia.
Bakteerien kalvon eheys	Kiinnittämättömät bakteerit; fluoresenssi	SYTO 9 yhdessä propidiumjodidin kanssa	Kalvovärjäys on epäsuora elinkyvyn mittari.

Yksinkertaisessa sivelyssä vaihda menetelmä harkiten

Kristallivioletti on käytännöllinen vaihtoehto, kun tehtävänä on tarkastella bakteerien morfologiaa yhdellä värillä. FDA:n Bacteriological Analytical Manual luettelee kaksi yksinkertaiseen värjäykseen soveltuvaa kristalliviolettiformulaatiota. Käytä dokumentoitua formulaatiota ja sen valmistusmenetelmää; pelkkä väriaineen nimi ei määritä käyttövalmista reagenssia.

Kristalliviolettia käytetään myös Gram-värjäyksessä, mutta tämä ei tee yksinkertaisesta kristalliviolettivärjäyksestä Gram-värjäystä. ASM:n Gram-värjäysprotokollassa erottelutulos perustuu siihen, että kristallivioletti, jodi, värinpoisto ja vastavärjäys toimivat määrätyssä järjestyksessä. Näiden vaiheiden pois jättäminen muuttaa sitä, mitä kuvasta voidaan päätellä. Katso ero artikkelista yksinkertainen värjäys verrattuna Gram-värjäykseen.

Nigrosiini tarjoaa toisen tavan tuoda ääriviivat näkyviin: se tummentaa taustan, kun taas bakteerisolut jäävät suhteellisen vaaleiksi. Merckin nigrosiiniohjeissa on hyödyllinen yksityiskohta, joka voi jäädä pois yleisluontoisesta korvaavien vaihtoehtojen luettelosta. Sen määritetty käyttöformulaatio sisältää formaldehydiä. Siksi yhteensopivuutta elävien solujen kanssa ei voi päätellä pelkästään sanoista ”negatiivivärjäys”, vaikka itse solut näyttävät värjäämättömiltä. Tarkista koko formulaatio ja näytteen valmistelu.

Elävien näytteiden kohdalla harkitse optiikan vaihtamista

Jos haluat seurata solujen liikkumista tai jakautumista, uuden väriaineen lisääminen voi hankaloittaa havainnointia. Kuten Nikon selittää oppaassaan läpinäkyvien näytteiden kontrastista, faasikontrasti ja differentiaalinen interferenssikontrasti eli DIC tekevät näytteet näkyviksi niiden optisten ominaisuuksien erojen avulla. Niillä voidaan tarkastella eläviä, värjäämättömiä soluja, jos mikroskoopissa on tarvittavat komponentit.

Tämä valinta säilyttää näytteen värjäämättömänä, mutta muuttaa saatavilla olevaa tietoa. Voit seurata rajaa tai liikettä tietämättä, mikä molekyyli tuotti kontrastin. Jos tutkimuskysymys koskee molekyylin sijaintia, valitse sen sijaan tarkoitukseen sopiva merkintämenetelmä.

Tumallisen DNA:n kohdalla Invitrogenin DAPI- ja Hoechst-väriaineiden vertailu erottaa DAPI:n yleisen käytön kiinnitetyissä soluissa paremmin soluihin läpäisevästä Hoechst 33342:sta, jota suositaan elävien solujen merkintään. Molemmat edellyttävät fluoresenssilaitteistoa. Kumpikaan ei ole suora korvaaja värilliselle kirkaskenttävärjäykselle.

Käsittele väriaineelle altistumista ja valaistusta koeolosuhteina. Vertaa värjättyjä ja värjäämättömiä valmisteita, kun mittauksesi kohteena on solujen käyttäytyminen.

Punainen solu ei automaattisesti ole kuollut solu

SYTO 9:ää ja propidiumjodidia käytetään usein yhdessä bakteerien kalvon eheyden arviointiin. BacLight-käyttöohje yhdistää ehjät kalvot vihreään värjäytymiseen ja vaurioituneet kalvot punaiseen värjäytymiseen. Tämä tulkinta on validoitava kyseiselle näytteelle.

Rosenbergin ja kollegoiden vuonna 2019 julkaistu tutkimus havainnollistaa ongelmaa. Lasilla fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa kasvatetuissa 24-hour E. coli -biofilmeissä noin 96% soluista näytti paikan päällä propidiumjodidipositiivisilta. Kirjoittajat arvioivat kuitenkin, että 82% oli viljeltävissä näytteen keräämisen jälkeen. Konfokaalikuvissa näkyi soluja, joiden vihreän sisäosan päällä oli punaiseksi värjäytynyttä materiaalia, mikä viittasi solunulkoisten nukleiinihappojen aiheuttamaan harhaanjohtavaan signaaliin.

Nämä prosenttiosuudet kuvaavat eri mittauksia tutkimuksen valmisteissa, eivät yleispätevää korjauskerrointa. Olennainen opetus on tarkistaa, mikä signaalin tuotti. Biofilmissä nukleiinihappoväriaine voi havaita materiaalia sekä solujen ulkopuolella että vaurioituneiden solujen sisällä. Elinkykyä koskevan päätelmän tueksi tutkijat suosittelevat täydentäviä mittauksia, kuten viljelyä tai metabolisen aktiivisuuden mittaamista, samalla kun he toteavat, että jokaisella menetelmällä on omat rajoituksensa.

Tarkista, mitä vaihtoehto todellisuudessa sisältää

Vaihtoehtoinen värjäysmenetelmä voi silti sisältää metyleenisinistä. Giemsa on tästä esimerkki: Merck kuvaa tuotettaan azure-eosiini-metyleenisiniliuokseksi, joka on tarkoitettu muun muassa veri- ja luuydinsivelyihin. Se voi olla eri menetelmä eri näytteelle, mutta se ei täytä vaatimusta metyleenisinisen poissulkemisesta.

Jos tietyn yhdisteen poissulkeminen kuuluu kokeeseen, tarkista reagenssin identiteetti ja formulaatio ennen kuvien vertailua. Opas methyl bluen, metyleenisinisen ja samankaltaisesti nimettyjen väriaineiden eroista käsittelee nimieroja.

Varmista korvaavan menetelmän toimivuus ennen tuloksen käyttämistä

Kun otat käyttöön uuden menetelmän, tee pieni vertailu edustavilla näytteillä ja sopivalla kontrollilla. Pidä mikroskoopin asetukset mahdollisuuksien mukaan vertailukelpoisina. Kirjaa reagenssin formulaatio, näytteen valmistelu, altistus ja kuvantamisolosuhteet, jotta paremman näköistä kuvaa voidaan tutkia eikä vain pitää parempana.

Arvioi onnistumista alkuperäisen tutkimuskysymyksen perusteella. Morfologian kohdalla arvioi, säilyvätkö solujen rajat ja järjestäytyminen tulkittavina. Tumamerkinnässä arvioi signaalin sijaintia ja taustaa. Elinkyvyn kohdalla vaadi näyttöä pelkän houkuttelevan värierottelun lisäksi. Laajempi opas metyleenisinivärjäyksestä ja laboratoriosovelluksista selittää, miten havainto ja näytteen valmistelu liittyvät toisiinsa.

Valitse vaihtoehto, joka säilyttää tarvitsemasi mittauksen. Väri on vain yksi syntyvän kuvan ominaisuus.