Paul Ehrlich ja metyleenisininen: miten väriaine auttoi muovaamaan lääkekehitystä

Paul Ehrlichin panos lääketieteeseen ei ollut lääke. Se oli näkemys siitä, miten lääkettä tulisi tarkastella.

Vuonna 1878 hän jätti väitöskirjan, jonka aloitusosan otsikko oli ”Värjäytymisen kemiallinen tulkinta”. Sen väite oli, että kudosleikkeen värjääminen ja kangaspalan värjääminen noudattavat samaa logiikkaa. Molemmissa väri kiinnittyy väriaineen ja materiaalin välisen kemiallisen affiniteetin vuoksi, ei siksi, että kudos olisi imukykyinen, rasvainen tai muodoltaan pigmenttiä vangitseva. Ehrlich oli varttuessaan seurannut, kuinka hänen serkkunsa, patologi Karl Weigert, valmisti värjättyjä leikkeitä. Hänen huomionsa kiinnittyi kuvien sijaan siihen, että väriaine valikoi, minne se kulkeutui.

Väite kuulostaa vaatimattomalta. Sitä se ei ole. Jos väriaine sitoutuu kudokseen kemiallisista syistä, värjäytymiskuvio kertoo kyseisen kudoksen kemiasta. Värjätty objektilasi lakkaa olemasta havainnollistus ja muuttuu mittaukseksi.

Hän jatkoi tästä välittömästi. Vuonna 1880 hän yhdisti metyleenisinisen happofuksiiniin ja kutsui seosta neutraaliksi väriaineeksi, neutralen Farbkörper. Se erotteli eri valkosolutyypit tavalla, johon tuolloin käytetyt yksittäiset väriaineet eivät pystyneet. Kaksi vuotta myöhemmin hän esitteli metyyliviolettiin perustuvan menetelmän tuberkuloosibasillien värjäämiseen, ja Koch otti menetelmän käyttöön omassa työssään.

Teoria, joka myöhemmin antoi näille käytännöille yhteisen perustan, on erillinen asia, ja sen ajoitus usein yksinkertaistetaan. Ehrlichin sivuketjuteoria, ajatus siitä, että aine vaikuttaa soluun niiden kemiallisen yhteensopivuuden vuoksi, kuuluu 1890-luvulle, ei väriainekokeiden vuosiin. Aiempi työ loi pohjaksi vakaumuksen: valikoivuus on kemiallista, ja siksi sitä voidaan etsiä sen sijaan, että siihen vain törmättäisiin sattumalta.

Koe, joka teki väriaineesta kartan

Vuonna 1885 Ehrlich julkaisi monografian elimistön hapentarpeesta. Sen alaotsikko kuvasi työtä värianalyyttiseksi tutkimukseksi. Menetelmänä oli ruiskuttaa väriaineita, joiden väri riippuu hapetusasteesta, ja verrata sitten, miten eri elimet pelkistivät niitä tai säilyttivät ne ennallaan. Väriainetta käytettiin mittavälineenä samaan tapaan kuin lämpömittaria: se kertoi kudoksen sisäisistä olosuhteista, joita ei voitu tutkia suoraan. Ehrlich kuvasi itse tavoitteekseen elävien elinten pelkistyskyvyn määrittämisen tiettyjen väriaineiden avulla.

Metyleenisinistä koskeva tulos julkaistiin vuonna 1886 artikkelissa väriaineen reaktiosta elävän hermoaineksen kanssa. Artikkeli oli esitetty lääketieteelliselle seuralle edellisen vuoden joulukuussa. Metyleenisinistä annettiin elävän eläimen verenkiertoon, minkä jälkeen ohuita kudosleikkeitä poistettiin ja altistettiin ilmalle. Näin kertynyt väritön väriaine hapettui takaisin siniseksi ja osoitti, minne se oli kerääntynyt. Hermosolut ja hermosäikeet värjäytyivät niin valikoivasti, että tekniikasta tuli vakiomenetelmä hermokudoksen havainnollistamiseen. Yhdiste ei enää ollut vain laboratoriopöydällä kuolleeseen kudosleikkeeseen levitettävä väriaine. Se oli merkkiaine, joka jakautui elävän kehon sisällä, ja tätä jakautumista voitiin tulkita.

Molempien kokeiden taustalla oleva ominaisuus on syytä ilmaista selvästi, sillä kaikki muu tässä kertomuksessa riippuu siitä. Metyleenisinisen muutos on palautuva. Sen pelkistynyt muoto, leukometyleenisininen, on väritön, ja joutuessaan kosketuksiin hapen kanssa se palautuu siniseksi kationiksi. Väriaineen glukoosiliuos on suljetussa purkissa väritön; purkin avaaminen muuttaa sen siniseksi. Ehrlichin kerrotaan osoittaneen tämän suoraan käsittelemällä värjättyjä leikkeitä rautakloridilla sekä ilmalla ja seuraamalla värin palautumista. Väriaine, joka vaihtaa väriä ympäristönsä hapetus-pelkistystilan mukaan, toimii ympäristönsä koettimena.

Näin rinnakkain oli kaksi ominaisuutta. Väriaine pystyi erottamaan yhden kudoksen toisesta. Ja väriaine voitiin kytkeä näkyväksi tai näkymättömäksi hapetusasteen muutoksella.

Jälkikäteen tarkasteltuna toinen ominaisuus on kemoterapian alku. Jos yhdiste sitoutuu yhteen kudostyyppiin mutta ei toiseen, sama yhdiste voisi saavuttaa yhden eliölajin mutta ei toista. Ehrlich ilmaisi päätelmän suoraan: jos taudinaiheuttaja voitiin värjätä valikoivasti, värjäytyminen saattoi osoittaa siihen kohdistuvaa erityistä haittaa. Väriainetta voisi siis käyttää lääkkeenä, jonka kohteena olisi tunkeutuja eikä potilas.

Ensimmäinen potilaalla tehty kokeilu ei koskenut malariaa. Vuonna 1890 Ehrlich raportoi yhdessä psykiatri Arthur Leppmannin kanssa, että metyleenisininen lievitti kipua lihasten, nivelten ja jänteiden neuralgisissa ja reumaattisissa vaivoissa. Miehet pohtivat, voisiko lääke vaikuttaa mielenterveyden häiriöihin, mutta päättivät olla kokeilematta sitä. Genovalainen italialaislääkäri Pietro Bodoni ryhtyi siihen silti. Hänen vuoden 1899 artikkelinsa otsikko käsittelee rauhoittavaa vaikutusta psykoosin eri muodoissa: hän kuvasi neljäntoista levottoman potilaan rauhoittumista ja totesi, että muut genovalaiset lääkärit käyttivät jo väriainetta samaan tarkoitukseen. Rauhoittava vaikutus ei ole sama asia kuin vaikutus itse sairauteen, ja tämä ero nousee tässä historiassa toistuvasti esiin.

Malariatyö tehtiin vuonna 1891 yhdessä patologi Paul Guttmannin kanssa Berliinin Moabitin sairaalassa. Metyleenisinistä annettiin kahdelle potilaalle, ja raportti ilmestyi Berliner klinische Wochenschrift -lehden numerossa 28. syyskuuta 1891. Ensimmäisessä tapauksessa potilas otti illalla 29. kesäkuuta kerralla 0.5 g väriainetta. Odotettu kohtaus ei kehittynyt täyteen mittaansa, ja ainoa myöhemmin kirjattu vaiva oli lievä kivulias virtsaaminen sekä sininen virtsa. Kuumekohtaukset hävisivät ensimmäisten päivien aikana, ja loiset olivat poistuneet verestä viimeistään kahdeksantena päivänä. Kirjoittajat tiivistivät itse, että heidän odotuksensa olivat täyttyneet kokonaan. Kaksi kontrolloimatonta tapausta ei ole osoitus. Laajempi kuvaus metyleenisinisestä ja malariasta, myös nykyajan tutkimuksista, kuuluu omalle sivulleen. Tässä kiinnostava kysymys on suppeampi: kuinka suuri osa Ehrlichin päättelystä kesti kohtaamisen loisen kanssa.

Missä päättely piti ja missä se petti

Mekanismista ei jäänyt paljon jäljelle, ainakaan Ehrlichin esittämässä muodossa. Selkeä malli, jossa litteä kolmirenkainen kationi liukuu loisen DNA:n emäsparien väliin, ei kestä tarkastelua Plasmodium-loisen kohdalla. Infektoitunut punasolu pelkistää metyleenisinisen niin helposti, ettei se saavu loiselle lainkaan tasomaisena kationina. Akridiiniväriaineisiin sopiva interkalaatioselitys ei sovi tähän väriaineeseen.

Näytön tukema kuva on mutkikkaampi. Metyleenisininen estää loisen glutationireduktaasia pitoisuuksilla, jotka potilaassa voidaan saavuttaa. Se estää hemin muuttumista hemotsoiiniksi, inertiksi pigmentiksi, jota loinen muodostaa välttääkseen oman hemoglobiinin hajotuksensa aiheuttaman myrkytyksen, suunnilleen yhtä tehokkaasti kuin klorokiini ja paljon tehokkaammin kuin kiniini. Sen hapetus-pelkistyskierto tuottaa myös reaktiivisia happilajeja solussa, joka tuottaa niitä jo ennestään. Vieläkään ei ole ratkaistu, mikä näistä on varsinainen mekanismi vai vaikuttavatko ne kaikki.

Asiaan liittyy vielä yksi mutkistava tekijä, jonka pitäisi ohjata kaikkien tätä yhdistettä koskevien historiallisten väitteiden tulkintaa. Tuon ajan kaupallinen metyleenisininen ei ollut yksi aine. Näytteet sisälsivät azure B:tä, yhdistettä, josta on poistunut yksi metyyliryhmä, ja vanhempiin liuoksiin sitä kertyi lisää. Azure B on metakromaattinen väriaine, jolla on eri kohteet: se värjää kaksijuosteisen DNA:n syvänsiniseksi ja RNA:n vihreäksi. Kahden eri kohteisiin kulkeutuvan väriaineen seos, jonka suhteita kukaan ei kirjannut, ei mahdollista yksiselitteistä väitettä siitä, mitä seoksen metyleenisininen teki.

Väriaine itse ei koskaan syrjäyttänyt kiniiniä. Menetelmä menestyi paremmin. Ehrlichin oppilas Wilhelm Roehl, joka työskenteli väriaine- ja lääkekonserni IG Farbenille, jatkoi väriainejohdannaisten kehittämistä trooppisten tautien lääkkeiksi ja toi käyttöön puuttuvan työkalun: lintumalariaan tartutetun kanarialinnun lääke-ehdokkaiden rutiiniseulontaan. Werner Schulemann muutti sitten sivuketjua, ja syntynyt fenotiatsiniumsuola paransi kokeellisen infektion. Se värjäsi potilaat yhä sinisiksi.

Kestäväksi tulokseksi osoittautui väriaineen tai rengasrakenteen sijaan sivuketju. Dialkyyliaminoalkyyliaminoryhmän lisääminen muutti molekyylin käyttäytymistä, ja tämä rakenneosa säilyi kaikissa myöhemmissä uudelleenmuokkauksissa. Kun ryhmä säilytetään ja fenotiatsiniumrengas vaihdetaan akridiiniin, tuloksena on kinakriini. Kun tilalle vaihdetaan kinoliini, tuloksena on klorokiini. Pamakiini, primakiini ja amodiakiini, jotka kaikki kuuluvat edelleen malarialääkkeiden joukkoon, sisältävät saman ryhmän. Hoitona epäonnistunut yhdiste tarjosi rakenneosan, joka onnistui.

Yhteys psykoosilääkkeisiin kulkee rengasrakenteen eikä lääkkeen kautta. Metyleenisinisen rakenteen selvittäminen johti Heinrich August Bernthsenin fenotiatsiinin perusrungon äärelle vuonna 1883. Tätä runkoa eri tavoin muunneltuna Rhône-Poulencin kemistit tutkivat 1940-luvulla etsiessään antihistamiineja. Yksi näistä yhdisteistä syntetisoitiin vuoden 1950 lopun tienoilla, ja sitä kokeili kirurgi Henri Laborit, joka huomasi sen jättävän potilaat rauhallisiksi ja välinpitämättömiksi. Sen ensimmäinen julkaistu psykiatrinen käyttö, maniapotilaalla, ajoittui tammikuuhun 1952. Ensimmäinen psykoosilääke ei siis niinkään polveudu Ehrlichin malarialääkkeestä vaan on sen väriaineen kaukainen sukulainen, josta hän aloitti.

Kolme tästä vaiheesta säilyttämisen arvoista toimintatapaa

1. ”Ensimmäinen lääketieteessä käytetty synteettinen lääke” kuvaa luokkaa, ja tarvittavat rajaukset ovat suurempia kuin ilmaus antaa ymmärtää. Ilmaus on vakiintunut; Schirmerin ja kollegoiden paljon siteerattu katsaus Neurobiology of Aging -lehdessä kutsuu metyleenisinistä aivan ensimmäiseksi lääketieteessä käytetyksi täysin synteettiseksi lääkkeeksi. Kloraalihydraatti otettiin käyttöön synteettisenä rauhoittavana aineena vuonna 1869, yli kaksikymmentä vuotta aiemmin. Vuoden 1891 artikkeli tarjoaa itse osan vastauksesta, sillä sen kirjoittajat nimeävät synteettisiä kuumelääkkeitä, jotka olivat jo epäonnistuneet malariaa vastaan, muun muassa kinoliinin, antipyriinin ja antifebriinin. Ehrlichin oma kuppaan tarkoitettu arseenivalmiste tuli vielä myöhemmin. Väittämän perusteltavissa oleva muoto koskee menetelmää eikä ensimmäisyyttä: metyleenisininen kuuluu varhaisimpiin synteettisiin yhdisteisiin, jotka valittiin vaikuttamaan tiettyyn eliöön kemiallisen valikoivuusteorian perusteella.
2. Valikoiva jakautuminen ei tarkoita valikoivaa hyötyä. Ehrlichin vuoden 1886 tulos oli, että väriaine kulkeutuu hermokudokseen. Se, minne yhdiste kulkeutuu, ja se, mitä se tekee perille päästyään, ovat kaksi eri mittausta, joista ensimmäinen on paljon helpompi tehdä. Tässä kuilussa useimmat metyleenisinistä ja aivoja koskevat väitteet ovat siitä lähtien eläneet.
3. Puhtaus kuuluu näyttöön, ei markkinointiin. Historiallinen aineisto on epäselvä juuri tästä syystä. Pienet rakenteelliset erot muuttavat sitä, minne yhdiste kulkeutuu. Siksi analyysitodistuksen on koskettava tiettyä erää, eikä sitä pidä esittää vain ilmoituksena siitä, että tuote on testattu. Myyjä, joka väittää tuotteen täyttävän farmakopean monografian vaatimukset mutta testaa vain raskasmetallit, väittää enemmän kuin raportti osoittaa. Blupreme hankkii metyleenisinisen lääkevalmistajalta ja testaa kaikki monografian määrittämät vaatimukset: tunnistuksen, puhtauden, orgaaniset epäpuhtaudet, jäännösliuottimet, alkuaine-epäpuhtaudet, hehkutusjäännöksen, mikrobiologiset raja-arvot ja bakteerien endotoksiinit. Raportti julkaistaan tuotteen yhteydessä, ja USP-laatuista metyleenisinistä käsittelevä sivu selittää nämä rajat sekä sen, miksi azure B:n tulos kannattaa tarkistaa ensimmäisenä.

Ajoitettu lähdepolku

Virstanpylväiden ajoitettu ketju, mukaan lukien Ehrlichiä edeltänyt väriainekemia sekä hänen jälkeensä tulleet laatuluokat ja vaatimukset, esitetään erikseen metyleenisinisen historiassa. Yhdisteen omaa identiteettiä käsitellään artikkelissa mitä metyleenisininen on.

Tämän kuvauksen taustalla olevat kuvataulut, jotka on jäljennetty Kraftsin, Hempelmannin ja Skórska-Stanian vuoden 2012 katsauksessa, eivät ole samanarvoisia lähteitä, ja yksi esimerkki osoittaa miksi. Vuoden 1891 kuvataulu on kokeen alkuperäinen dokumentti; sen vieressä oleva vuoden 1910 muotokuva ajoittaa vain maineen, ei muuta. Andersagin vuoden 1934 muistikirjan sivut ovat suora jälki kinoliinilla korvaamisesta, kemistin omalla käsialalla.

Rehellinen yhteenveto Ehrlichin väriainekokeista on, että hän osui oikeaan valikoivuudessa ja kohteessa mutta erehtyi mekanismista. Metyleenisininen todella kertyy hermokudokseen ja todella vahingoittaa malarialoista. Jälkimmäinen ei johdu ensimmäisestä, ja hänen molemmille esittämänsä kemiallinen selitys oli väärä. Hän osoitti kiistattomasti jotakin oikeaa mekanismia kestävämpää: yhdiste voidaan valita sen sijaan, että se löydettäisiin sattumalta, ja valinta voidaan tehdä sellaisen näytön perusteella, joka on kerätty ennen kuin kukaan antaa sitä potilaalle.