Metyleenisinisen liukoisuus ja liuoksen valmistus: laboratorio-opas

Kaksi laboranttia valmistaa kumpikin jauheesta 1 prosentin metyleenisiniliuoksen. Toinen punnitsee 1.00 grammaa ja täyttää mittapullon 100 mL:n merkkiin. Toinen punnitsee 1.00 grammaa, lisää sen 100 mL:aan vettä ja katsoo työn valmiiksi. Kolmas laborantti punnitsee 1.00 grammaa toisesta erästä ja saa mitattavasti erilaisen pitoisuuden. Kaikissa kolmessa pullossa on sama etiketti. Yhdenkään sisältö ei vastaa aivan etiketin tietoja, ja erot johtuvat kolmesta helposti sekoittuvasta asiasta: kuinka paljon liuotin voi liuottaa, mitä punnittu jauhe todellisuudessa on ja mihin prosenttiluku viittaa.

Tämä opas käsittelee vain liuosten valmistamista laboratoriokäyttöön: värjäysliuoksia, indikaattoreita, analyyttisiä kantaliuoksia ja käyttölaimennoksia. Se ei ole ohje suun kautta otettavan tai injektoitavan lääkkeen valmistamiseen, eikä tässä esitettyjä pitoisuuksia pidä tulkita annoksiksi.

Mitä liukoisuus määrää ja mitä ei

Metyleenisinisen liukoisuus veteen on väriaineeksi suuri. Metyleenisinisen PubChem-tietueessa ilmoitetaan liukoisuudeksi noin 43.6 grammaa litrassa lämpötilassa 25 C. Tämä vastaa 4.36 grammaa 100 mL:ssa eli 4.36 prosenttia w/v. Riippumattomassa tasapainotustutkimuksessa mitattiin samassa lämpötilassa 43.21 g/L, mikä vahvisti aiemman arvon mittausvirheen rajoissa.

Tämä luku on yläraja, ei tavoite. 1 prosentin kantaliuos sisältää 10 g/L, alle neljäsosan ylärajasta. 0.1 prosentin kantaliuos sisältää 1 g/L, suunnilleen yhden neljäskymmenesosan siitä. Jos 1 prosentin liuokseen jää kiinteää ainetta asianmukaisen huoneenlämmössä tehdyn sekoituksen jälkeen, syynä ei lähes koskaan ole liukoisuusraja. Tavallisesti kyse on puutteellisesta kostumisesta, kylmästä vedestä, enemmän aikaa vaativista jauhepaakuista tai väärin tunnistetusta liuotettavasta aineesta. Lämmin vesi ja sekoittaminen ratkaisevat useimmat näistä ongelmista. Jos liuosta lämmitettiin, anna mittapullon palautua kalibrointilämpötilaansa ennen lopputilavuuteen täyttämistä.

Liukoisuus muihin liuottimiin on pienempi, ja lähteiden väliset erot ovat suurempia. Tämä johtuu osittain siitä, että tutkittujen materiaalien hydraattimuoto vaihtelee. Vesi on edelleen vertailuliuotin tavanomaisten laboratoriokantaliuosten valmistuksessa. Etanoli liuottaa väriainetta, mutta huomattavasti vähemmän kuin vesi. Myös kloroformi liuottaa sitä, pyridiini vain hieman ja dietyylieetteri käytännössä ei lainkaan. Mittaussarjoissa liukoisuus asetoniin ja etyyliasetaattiin jää selvästi vesiliukoisuutta pienemmäksi. Kun työskentelet vedettömillä liuottimilla, käsittele käsikirjojen arvoja alustavina arvioina ja varmista ne käytettävällä erällä sen sijaan, että pitäisit niitä liuoksen valmistuksen raja-arvoina. Käytännön johtopäätös on yksinkertainen: jos tavoitteena on määritelty vesiliuoksen pitoisuus, joka on enintään 1 prosentti, vesi jättää runsaasti liukoisuusvaraa.

Jauhe ei ole aina samanlaista

Laboratoriokäyttöön myytävä metyleenisinijauhe on kloridisuola, jonka kidehilassa on vettä. Veden määrä vaihtelee. Vedettömän ionin molekyylipaino on 319.85 g/mol. Yleisesti mainitun trihydraatin molekyylipaino on 373.90 g/mol ja pentahydraatin 409.93 g/mol. Nämä arvot on esitetty PubChem-tietueen yhteydessä kootuissa USP-monografian tiedoissa.

Kaupallisten pullojen etiketeissä lukee usein trihydraatti, CAS 7220-79-3. Kiinteän olomuodon tutkimuksissa on kuitenkin havaittu, että materiaali voi todellisuudessa olla pentahydraatti, osittainen hydraatti, jossa on noin 2.2 vesimolekyyliä, dihydraatti tai monohydraatti. Joissakin analyyseissä erillistä kiteistä trihydraattifaasia ei ole havaittu. Väriaine on myös hygroskooppinen, joten avatun pullon vesipitoisuus muuttuu ajan mittaan. Kvalitatiivisessa värjäyksessä tällä on tuskin merkitystä. Kvantitatiivisessa analyysityössä sillä on suuri merkitys. Siksi ohje analyysitodistuksen pitoisuusmäärityksen ja vesipitoisuuden tulkitsemiseen pitää eräkohtaista asiakirjaa luotettavampana kuin etiketin trihydraatti-merkintää.

Tästä seuraa kaksi korjaustapaa, joista tulee käyttää vain yhtä kerrallaan. Jos todistuksessa ilmoitetaan pitoisuusmäärityksen tulos sekä vesipitoisuus tai kuivaushäviö, käytä näitä lukuja suoraan. Jos todistustietoja ei ole ja pitoisuus on ilmaistava vedettömän aineen ekvivalenttina, käytä teoreettista hydraattikerrointa: nimelliselle trihydraatille 373.90 jaettuna 319.85:llä eli 1.169 ja nimelliselle pentahydraatille 409.93 jaettuna 319.85:llä eli 1.282. Älä käytä molempia korjauksia samanaikaisesti. Silloin vesi huomioidaan kahdesti.

Mitä prosentti tarkoittaa

Prosentti w/v tarkoittaa määritellyn liuotettavan aineen grammoja 100 mL:ssa valmista liuosta, ei 100 mL:ssa lähtövettä. Näin ollen 1 prosentti w/v tarkoittaa 1.000 g:aa 100 mL:n lopputilavuudessa, mikä vastaa 10 mg/mL:aa tai 10 g/L:aa. 0.1 prosentin liuos sisältää 0.100 g 100 mL:n lopputilavuudessa, mikä vastaa 1 mg/mL:aa. Yleinen sekaannus, jossa 1 prosentti rinnastetaan pitoisuuteen 1 mg/mL, aiheuttaa kymmenkertaisen virheen. Jokainen etiketti kannattaa tarkistaa tämän varalta.

Määritelmän toinen osa on liuotettavan aineen täsmennys. Punnitun trihydraattijauheen perusteella valmistettu 1 prosentin liuos ja vedettömän aineen ekvivalenttina ilmaistu 1 prosentin liuos ovat erilaisia liuoksia. Alla olevissa laskuesimerkeissä ilmoitetaan joka kerta sekä lopputilavuus että pitoisuuden laskentaperuste. Tämä käytäntö ehkäisee edellä kuvattua kolmen laborantin ongelmaa.

Valmistusesimerkkejä, joissa hydraattioletukset ilmoitetaan

Kaikissa esimerkeissä oletetaan, että käytössä on puhdas jauhe ilmoitetussa hydraattimuodossa ja liuottimena vesi huoneenlämmössä. Skaalaa määrät lineaarisesti muihin tilavuuksiin.

Esimerkki A: 100.0 mL 1 prosentin w/v-liuosta punnitun trihydraatin perusteella. Punnitse 1.000 g metyleenisinistrihydraattia. Lisää noin 70 mL puhdistettua vettä ja sekoita tai pyörittele, kunnes aine on liuennut kokonaan. Siirrä liuos kvantitatiivisesti huuhteluvesineen 100.0 mL:n mittapulloon ja lisää sitten vettä merkkiin asti. Liuotettava aine on trihydraatti itse, joten molekyylipainokorjausta ei käytetä. Tulos: 1.000 g 100.0 mL:n lopputilavuudessa eli 10 mg/mL punnittua jauhetta.

Esimerkki B: 100.0 mL pitoisuudeltaan 1 mg/mL olevaa liuosta vedettömän aineen ekvivalenttina nimellisestä trihydraatista. Tavoitteena on 100.0 mg vedetöntä metyleenisiniä 100.0 mL:n lopputilavuudessa. Korjaa kolmen vesimolekyylin osuus kertomalla luvulla 1.169: 100.0 mg kertaa 1.169 on 116.9 mg. Punnitse 116.9 mg nimellistä trihydraattia, liuota noin 70 mL:aan vettä ja täytä mittapullossa lopputilavuuteen 100.0 mL. Nimellisen pentahydraatin kerroin on 1.282, joten sama tavoite vaatii 128.2 mg. Kirjaa etikettiin, mitä kerrointa käytettiin.

Esimerkki C: metyleenisinisen laimentaminen 1 prosentin kantaliuoksesta 0.1 prosenttiin. Käytä yhtälöä C1V1 = C2V2. Kun valmistetaan 100.0 mL 0.1 prosentin liuosta 1.0 prosentin kantaliuoksesta, tarvittava kantaliuoksen tilavuus on 0.1 kertaa 100.0 jaettuna 1.0:lla eli 10.0 mL. Pipetoi 10.0 mL 1 prosentin kantaliuosta 100.0 mL:n mittapulloon ja lisää vettä merkkiin asti. Massayksiköitä suosiville analyytikoille: 1 prosentti on 10 mg/mL, joten 10.0 mL sisältää 100 mg. Kun 100 mg on 100.0 mL:n lopputilavuudessa, pitoisuus on 1 mg/mL eli 0.1 prosenttia.

Esimerkki D: 1.000 L pitoisuudeltaan 10 mg/L olevaa käyttöliuosta 1 mg/mL:n kantaliuoksesta. Kantaliuos, jonka pitoisuus on 1 mg/mL, vastaa pitoisuutta 1000 mg/L. Tarvittava tilavuus on 10 kertaa 1.000 jaettuna 1000:lla eli 0.0100 L tai 10.0 mL. Pipetoi 10.0 mL kantaliuosta ja laimenna vedellä lopputilavuuteen 1.000 L. Kun lähtökohtana on 1 prosentin kantaliuos, jonka pitoisuus on 10,000 mg/L, samaan tavoitteeseen tarvitaan vain 1.00 mL laimennettuna lopputilavuuteen 1.000 L. Kaksivaiheinen sarjalaimennus antaa paremman tarkkuuden kuin yksittäinen mikrolitratilavuuden siirto, kun laimennussuhde ylittää noin sadan.

Jokainen näistä on täydellinen määritys vain siksi, että se sisältää kolme tietoa: punnitun massan ja siihen liittyvän hydraattioletuksen, liuoksen lopputilavuuden sekä ilmoitetun pitoisuuden laskentaperusteen. Jos yksikin näistä puuttuu laboratoriopäiväkirjan merkinnästä, valmistusta ei voi toistaa täsmälleen.

Menettely, joka ehkäisee tavalliset virheet

Liuota jauhe ensin lopputilavuutta pienempään vesimäärään ja täytä vasta sitten lopputilavuuteen. Jos jauhe lisätään suoraan lopputilavuuden suuruiseen vesimäärään, liuoksen kokonaistilavuus ylittää tavoitellun merkin ja pitoisuus jää liian pieneksi. Huuhtele dekantterilasin sisältö mittapulloon niin, ettei väriä jää jäljelle. Voimakas väri tekee pienet häviöt näkyviksi, mikä on etu, jos se auttaa varmistamaan kvantitatiivisen siirron.

Sekoita, kunnes hiukkasia ei enää ole, ennen kuin täytät lopputilavuuteen. Tarkastele liuosta valoa vasten. Suodata vain, jos menetelmä edellyttää sitä. Metyleenisini adsorboituu joihinkin kalvomateriaaleihin, joten suodatus voi pienentää juuri standardoidun kantaliuoksen pitoisuutta. Tämä on dokumentoitu kalvojen adsorptiotutkimuksissa, ja se kannattaa muistaa aina, kun suodatus tai pitoisuuden varmistaminen on osa menetelmää. Jos suodatetun kantaliuoksen pitoisuuden on oltava varmennettu, varmista pitoisuus suodatuksen jälkeen, ei ennen sitä.

Säilytä valmistetut liuokset huoneenlämmössä voimakkaalta valolta suojattuina ruskeissa tai läpinäkymättömissä pulloissa. Merkitse etikettiin liuotettava aine, hydraattiperuste, pitoisuus, liuotin, päivämäärä ja valmistaja. Jatkuvan valaistuksen aiheuttama fotovalkaistuminen on tunnettu hajoamisreitti, joten ikkunalaudat ja valaistut jääkaapit ovat huonoja säilytyspaikkoja, vaikka väriaine vaikuttaisi stabiililta. Odotettu säilyvyys ja uudelleentestausvälit kuuluvat valmistettujen liuosten säilytys- ja stabiilisuusohjeisiin. Käytännön sääntönä analyyttiset kantaliuokset on kuitenkin syytä valmistaa tuoreina tai varmistaa uudelleen sen sijaan, että niihin luotettaisiin rajattomasti.

Käsittele jauhetta ja väkeviä kantaliuoksia käyttäen suojakäsineitä, silmiensuojaimia, laboratoriotakkia ja työpöydän suojausta. Käytä pulloille myös vuotosuoja-allasta. Väriaine tahraa nopeasti ihoa, vaatteita, työpöytiä ja muoveja. Toimittajien käyttöturvallisuustiedotteissa jauhe luokitellaan laadusta riippuen haitalliseksi nieltynä sekä silmiä ja ihoa ärsyttäväksi. Kattavat varotoimet kuuluvat turvallisen käsittelyn ja säilytyksen ohjeisiin, mutta tahriintumisen ehkäisy on itsessään laadunvarmistustoimi: lasivälineisiin ja pipetteihin päätynyt ylimääräinen väriaine on hivenaineanalyysissä ristikontaminaation lähde.

Huomio laatuluokasta

Värjäyskylpyihin ja demonstraatioihin soveltuu mikä tahansa puhdas laboratoriolaatu, kun liuos valmistetaan oikeaan pitoisuuteen. Kvantitatiivisessa tai vertailevassa työssä laatuluokalla on merkitystä, koska epäpuhtaudet vaihtelevat: Azure B:n ja muiden samankaltaisten tiatsiinien jäämät, raskasmetallit, liuotinjäämät ja mikrobikuorma. Siksi kattavalla analyysitodistuksella varmennetun laatuluokan valitseminen on osa liuoksen valmistusta eikä jälkikäteen tehtävä päätös. Täydellisessä eräasiakirjassa ilmoitetaan tunnistetiedot, pitoisuusmäärityksen tulos laskentaperusteineen, vesipitoisuus ja tosiasiallisesti tutkittu epäpuhtausvalikoima. Näin edellä olevien esimerkkien hydraattikorjauksessa voidaan käyttää mitattuja arvoja nimellisen trihydraattioletuksen sijaan. Kun kahdesta erästä saadaan samalla punnitulla massalla eri pitoisuudet, analyysitodistus yleensä selittää syyn.