Miksi metyleenisinisen absorptio muuttuu pitoisuuden mukana

Ota pullo metyleenisinisen kantaliuosta ja kaada siitä kahteen lasiin. Täytä ensimmäinen kantaliuoksella ja toinen kymmenkertaisella laimennoksella. Toisen lasin liuos on odotetusti vaaleampi. Kun katsot tarkasti, huomaat muutakin muuttuneen. Värisävy on vaihtunut. Toinen liuos on lähempänä kirkasta taivaansinistä, toinen violetinsävyistä sinistä. Laimennus ei vain vähentänyt värin voimakkuutta. Se muutti sitä, mikä kemiallinen laji vastaa suurimmasta osasta absorptiota.

Muutoksen taustalla oleva ajatus on yksinkertainen. Liuennut metyleenisininen ei esiinny vain yhtenä kemiallisena lajina. Yksittäinen väriainekationi eli monomeeri voi pinoutua vastakkain toisen kationin kanssa dimeeriksi, ja dimeereistä voi muodostua suurempia aggregaatteja. Jokaisella muodolla on oma absorptiospektrinsä. Spektrofotometrin ilmoittama tulos on kyseisessä kyvetissä ja kyseisissä olosuhteissa olevan seoksen osatekijöiden summa. Kun seos muuttuu, spektri muuttuu, vaikka väriaineen kokonaispitoisuus noudattaisi suoraan laimennussuhdetta.

Monomeeri ja dimeeri absorboivat eri tavoin

Kuvittele monomeeri litteäksi kortiksi, jonka positiivinen varaus on jakautunut rengasjärjestelmään. Kaksi tällaista korttia voi asettua vastakkain. Positiiviset varaukset hylkivät toisiaan, mutta litteät aromaattiset pinnat vetävät toisiaan puoleensa pinoutumisvuorovaikutusten kautta, ja ympäröivä vesi sekä vastaionit suojaavat hylkimiseltä. Tuloksena on sitoutunut pari, jolla on yhteisiä elektronitiloja. Sen sallitut siirtymät ovat energialtaan monomeerin siirtymää korkeampia, joten dimeerin absorptiovyö on lyhyemmällä aallonpituudella kuin monomeerin vyö. Suuremmat aggregaatit tuovat spektriin lisäksi olakkeen vielä lyhyempien aallonpituuksien eli sinisen suuntaan.

Hyvin pienessä pitoisuudessa puhtaassa vedessä monomeerit ovat vallitsevia, ja pitkän aallonpituuden vyö hallitsee spektriä. Kokonaispitoisuuden kasvaessa parimuodon osuus suurenee, ja lyhyemmän aallonpituuden vyö vahvistuu suhteessa ensimmäiseen. Kahden vyön suhde kertoo siis seoksen koostumuksesta, ei suoraan kokonaispitoisuudesta. Mittaus yhdellä aallonpituudella ei pysty erottamaan näitä kahta ilman oletusta siitä, kumpaa muotoa liuoksessa esiintyy.

Siksi vertailuspektreihin on aina liitettävä olosuhdetiedot. Metyleenisinisen spektrien vertailutiedot esittävät vyöjen sijainnit taulukossa yhdessä niiden mittauksessa käytetyn liuottimen, suolataustan, pH:n, lämpötilan ja pitoisuusalueen kanssa. Jos ilmoitat huipun ilman näitä olosuhteita, tieto jää puutteelliseksi. Kaksi laboratoriota voi saada samasta väriaineesta erilaiset spektrit ja silti molemmat olla oikeassa, koska ne mittasivat erilaisia seoksia.

Mikä siirtää tasapainoa

Pitoisuus on tärkein säätötekijä. Dimeerin muodostuminen edellyttää kahden monomeerin kohtaamista, joten sen osuus kasvaa kokonaisväriainepitoisuutta nopeammin. Vedessä mitatut dimerisaatiovakiot ovat lähellä huoneenlämpötilaa suuruusluokaltaan tuhansia molaarisen pitoisuuden käänteisyksikössä, joten dimeerin osuus kasvaa jyrkästi mikromolaarisella alueella. Laaja yhteissovitus, joka kattoi väriainepitoisuudet mikromolaarisista millimolaarisiin, osoitti tetrameerin osuuden olevan nollasta poikkeava jo alle 34 mikromolaarisessa pitoisuudessa. Tämä varoittaa luottamasta tiukasti kahden lajin sovitukseen kymmenien mikromolaarien pitoisuuksissa. Tarkat osuudet riippuvat väliaineesta, minkä vuoksi tämä artikkeli kuvaa muutosten suuntia yleispätevän muunnostaulukon sijaan.

Suola on toinen säätötekijä. Liuenneet ionit suojaavat kahta kationia niiden väliseltä hylkimiseltä, joten lisätty natriumkloridi ja vastaavat elektrolyytit siirtävät seosta kohti dimeerejä ja aggregaatteja samalla väriainepitoisuudella. Vaikutus näkyy tutkimuksissa metyleenisinisen aggregaatiosta suolaliuoksissa ja vesipohjaisissa väliaineissa. Niissä väriainepitoisuuksia noin 1 mikromolaarista 3.4 millimolaariseen mitattiin natriumkloridipitoisuuksilla 0–0.15 molaarista. Tässä sovituksessa tetrameerin osuus nousi noin arvoon 0.93 suurimpien väriaine- ja suolapitoisuuksien yhdistelmässä. Vedessä ja fysiologisessa suolaliuoksessa mitatut spektrit eivät siis ole keskenään vaihdettavia vertailuja.

Lämpötila vaikuttaa vastakkaiseen suuntaan. Pinoutuminen vapauttaa sitoutunutta vettä, ja lämpöliike vastustaa sitä. Liuoksen lämmittäminen hajottaa siksi tavallisesti osan dimeereistä takaisin monomeereiksi, kun taas jäähdyttäminen suosii yhteen liittymistä. Sovitettu dissosiaatioentalpia on negatiivinen, noin miinus 30 kilojoulea moolia kohti lämpötila-alueella 282–333 kelviniä, mikä vahvistaa yhteen liittymisen olevan eksotermistä. Heti kylmäsäilytyksen jälkeen mitattu kylmä näyte voi näyttää aggregoituneemmalta kuin sama näyte sen tasaannuttua huoneenlämpötilaan.

Liuotin määrittää lähtötilanteen. Veden voimakas hydrofobinen vaikutus edistää litteiden väriainekationien pinoutumista. Alkoholit, kuten etanoli ja metanoli, solvatoivat renkaita paremmin ja hajottavat aggregaatteja, joten samalla väriainepitoisuudella liuos näyttää etanolissa monomeerivaltaisemmalta kuin vedessä. Aproottiset apuliuottimet vaikuttavat samoin: veden ja DMSO:n seoksissa 293 kelvinin lämpötilassa lisätty DMSO vähensi dimerisaatiota, mikä viittaa veden rakenteeseen pinoutumista edistävänä tekijänä. Pinta-aktiivisten aineiden vaikutuksia on tarkasteltava molempiin suuntiin. Kriittisen misellipitoisuuden yläpuolella misellit voivat solubilisoida monomeereja yksittäin ja palauttaa monomeerille tyypillisen spektrin. Tämän rajan alapuolella vastakkaismerkkisesti varautunut pinta-aktiivinen aine voi sen sijaan edistää pinoutumista: väriainepitoisuuden ollessa 100 mikromolaarinen SDS:n aikaansaama polymerisaatio saavutti huippunsa lähellä 4 millimolaarista SDS-pitoisuutta, noin puolessa misellien muodostumisrajasta, ennen uudelleenjakautumista suuremmilla pinta-aktiivisen aineen pitoisuuksilla. Väriaineen ja liuottimen sekä järjestäytyneiden väliaineiden vaikutuksia metyleenisinisen spektreihin käsittelevä tutkimus havainnollistaa, kuinka voimakkaasti välitön molekyyliympäristö, ei vain kokonaispitoisuus, määrää havaitut vyöt.

pH vaikuttaa lähinnä äärialueilla. Useimmissa laboratoriotöissä käytetyllä lähes neutraalilla alueella metyleenisininen pysyy tutussa kationisessa sinisessä muodossaan, ja aggregaatio hallitsee spektrin muutoksia. Vahva happo tai emäs, värittömän leukomuodon tuottavat hapetus-pelkistysreaktiot sekä sitoutuminen proteiineihin tai hiukkasiin tuovat kaikki mukaan muita tiloja monomeeri–dimeeriparin lisäksi. Kun spektri muuttuu puskurin lisäämisen jälkeen, tarkista puskurin koostumuksesta suolat ja sitovat aineosat ennen kuin selität kaiken pelkällä pH:lla. Kemiaa ja protonoitumista käsittelevä vertailuaineisto pitää nämä kemiallista identiteettiä koskevat kysymykset erillään tässä käsiteltävästä aggregaatiosta.

Miksi Beer–Lambertin suora taipuu

Beer–Lambertin lain mukaan absorbanssi on absorptiokertoimen, pitoisuuden ja optisen matkan tulo. Se on lukumäärään perustuva laki. Se olettaa, että laskettavat kohteet pysyvät samanlaisina niiden määrän muuttuessa: yksi absorboiva laji, muuttumaton spektri, ei pitoisuudesta riippuvia kemiallisia muutoksia, monokromaattinen mittausvalo, ei sirontaa tai uudelleenemissiota sekä valo, joka todella kulkee ilmoitetun matkan.

Aggregaatio rikkoo ensimmäisen oletuksen. Muodollisesti kokonaisabsorbanssi on edelleen eri lajien osuuksien summa: optinen matka kerrottuna kunkin lajin absorptiokertoimella ja sen omalla pitoisuudella. Jokainen laji noudattaa lakia. Seos ei noudata sitä, koska lajien pitoisuudet riippuvat epälineaarisesti väriaineen kokonaispitoisuudesta. Monomeerivyön absorbanssin kalibrointikäyrä väriaineen kokonaispitoisuuden funktiona on siksi laimealla alueella aluksi suora ja taipuu alaspäin pitoisuuden kasvaessa, koska jokainen lisäys tuo suhteellisesti vähemmän monomeeria. Dimeerivyöstä mitattu käyrä taipuu toiseen suuntaan. Aggregaatiotutkimukset tunnistavat juuri tämän mekanismin havaittujen Lambert–Beer-poikkeamien aiheuttajaksi. Tavallinen virhe on sovittaa suora taipuneen alueen läpi ja ekstrapoloida sitä. Suora pätee vain sillä alueella ja siinä matriisissa, jossa se muodostettiin.

Laimennus aiheuttaa samankaltaisen sudenkuopan. Väkevän kantaliuoksen laimentaminen laitteen mittausalueelle ei säilytä lajien suhdetta. Laimennettu kyvettiliuos tasapainottuu uudelleen monomeerin suuntaan, joten sen spektri kuvaa laimennettua näytettä oikein mutta kantaliuosta väärin. Kantaliuoksen spektrin takaisinlaskenta skaalaamalla absorbansseja ylöspäin palauttaa arvion kokonaispitoisuudesta vain, jos kalibrointi ottaa muutoksen jo huomioon. Alkuperäistä vyön muotoa se ei koskaan palauta. Väkevän liuoksen spektrin vertaaminen laimeaan vertailuun on kahden erilaisen seoksen vertaamista.

Optinen matka on osa tulosta

Absorbanssi skaalautuu sen matkan mukaan, jonka valo kulkee näytteen läpi. 10 mm:n kyvetti antaa kymmenkertaisen absorbanssin verrattuna 1 mm:n kyvettiin, jossa on samaa liuosta. Skaalaus on tarkka vain samalle liuokselle, ja aggregaatio tekee tästä ehdosta ratkaisevan.

Käytännössä optinen matka on keino pysyä pätevällä mittausalueella. Pitkä matka parantaa herkkyyttä laimeille, pääasiassa monomeerisille liuoksille. Lyhyt matka pitää väkevän näytteen mittausalueella ilman suurta laimennusta, joka muuttaisi tasapainon. Edellä esitettyjen lukujen taustalla olevassa aggregaatiotutkimuksessa toimittiin juuri näin: 1 senttimetrin kyvettejä käytettiin 1.1–34 mikromolaarisille väriainepitoisuuksille ja 0.01 senttimetrin kyvettejä 94 mikromolaarisista 3.4 millimolaarisiin pitoisuuksiin. Mikrotilavuuslaitteiden mittausalustat ja mikrolevylukijat tuovat mukaan oman geometriansa: optiset matkat ovat lyhyitä ja joskus vaihtelevia, ja niissä on pintoja, joihin kationinen väriaine voi adsorboitua. Ilmoita optinen matka mittaustuloksen yhteydessä samalla tavoin kuin spektrien vertailutiedoissa ilmoitetaan liuotin ja suola. Absorbanssi ilman optista matkaa ei ole tulos. Se on huhu.

Mekanismi määrittää huolellisen mittauskäytännön. Anna näytteiden tasaantua samaan lämpötilaan ennen mittausta. Käytä samantyyppisiä kyvettejä samassa asennossa, vastaavia nollanäytteitä, joissa on sama suola- ja puskuritausta, sekä puhtaita lasivälineitä. Metyleenisininen adsorboituu lasiin ja muoviin, ja värjäytynyt kyvetti kantaa muistijälkeä edellisestä väkevästä näytteestä. Mittaa pian valmistuksen jälkeen, kun aggregaation kinetiikalla on merkitystä, ja muodosta jokainen kalibrointikäyrä samassa matriisissa ja samalla optisella matkalla kuin tuntemattomat näytteet. Muista silmämääräisessä tarkastelussa, että silmä on huono spektrometri. Se, voiko liuoksen väri osoittaa puhtauden, on erillinen kysymys, johon vastaus on kielteinen. Aggregaation aiheuttamat sävymuutokset ovat yksi syy tähän.

Kaavio laitteen viereen

Alla oleva kuva tiivistää artikkelin yhdeksi laboratoriotyön muistilistaksi. Kolmessa liuoksessa on samaa väriainetta, mutta niiden kokonaispitoisuudet ja suolataustat eroavat toisistaan. Kaavamaiset spektrit näyttävät, kuinka pitkän aallonpituuden monomeerivyön osuus pienenee lyhyemmän aallonpituuden dimeerivyöhön nähden pinoutumisen lisääntyessä. Olosuhteet on merkitty kuvaan, koska ilman niitä käyriä ei voi käyttää uudelleen. Ilmoitetuissa olosuhteissa mitattuja vyöjen sijainteja varten käytä spektrien vertailutietoja. Väriaineen siirtymisestä soluihin sen ollessa liuoksessa kerrotaan artikkelissa soluihin siirtyminen pelkistymisen ja jakautumisen kautta. Valoannoksen ja geometrian lisävaikutuksia fotokemiallisiin mittaustuloksiin käsitellään artikkelissa valoaltistus ja mittausgeometria.

Muistettava sääntö on kaksiosainen. Spektri kertoo, millainen seos kyvetissä on ilmoitetuissa olosuhteissa. Vain samoissa olosuhteissa muodostettu kalibrointi muuntaa absorbanssin kokonaispitoisuudeksi.