Metyleenisininen, tau ja amyloidi: proteiinien poistumismekanismien vertailu

Kun kysyt, mitä metyleenisininen tekee Alzheimerin tautiin liittyville proteiineille, saat usein yhden varman vastauksen, vaikka pitäisi saada kolme varauksin esitettyä vastausta. Koeputkessa se häiritsee tauproteiinien kiinnittymistä toisiinsa. Yhdessä hiirimallissa se vähentää liukoista amyloidia vaikuttamatta tauhun. Toisessa se vähentää sen entsyymin toimintaa, joka alun perin tuottaa amyloidia. Kaikki nämä havainnot ovat todellisia. Mikään niistä ei kerro koko tarinaa, eivätkä ne kaikki toteudu samassa eläimessä samaan aikaan. Tämä artikkeli erottaa nämä kolme havaintoa toisistaan, jotta yhden kokeen tulosta ei enää esitetä toisen tuloksen todisteena.

Lukijoiden, jotka haluavat laajemman kuvan siitä, miten metyleenisininen toimii solujen sisällä, kannattaa aloittaa siitä. Lukijoiden, jotka haluavat tietää, auttoiko mikään tästä potilaita, kannattaa lukea Alzheimerin taudin kliinistä tutkimusnäyttöä käsittelevä katsaus, johon ihmisillä tehtyjen tutkimusten tulokset kuuluvat. Tämä artikkeli ei toista tuota katsausta.

Tauhavainto koskee aggregaatiomäärityksiä

Vanhin näistä kolmesta tutkimuslinjasta perustuu soluttomiin kokeisiin taulla, joka on neurofibrillaarisia kimppuja muodostava proteiini. Tau–tau-sitoutumismäärityksessä taun fragmentit järjestäytyvät parittaisiksi kierteisiksi filamenteiksi, ja fenotiatsiinivärit, kuten metyleenisininen, estävät tämän muodostumisen pienillä mikromolaarisilla pitoisuuksilla. Myöhemmät biokemialliset tutkimukset antoivat tälle kemiallisen selityksen: väriaine hapettaa taun kysteiinitähteitä, mikä vakauttaa monomeerisen muodon ja estää muuten kasvavien fibrillien muodostumista. Taun aggregaatiota estävien pitoisuuksien on raportoitu olevan suunnilleen yksinumeroisista mikromolaarisista pitoisuuksista muutamien kymmenien mikromolaarisiin pitoisuuksiin. Tämä vaihteluväli on olennainen kaiken seuraavan kannalta.

Huomaa, millaisesta väitteestä on kyse. Se ei kerro mitään taun tuotannosta, taun fosforylaatiosta elävissä aivoissa tai taun poistumisesta. Se kertoo, että määritellyissä koeputkiolosuhteissa hapettunut väriaine estää tauproteiinien kasaantumista. Tulos on täsmällinen, rajattu ja hyödyllinen. Ongelmat alkavat, kun se venytetään yleiseksi väitteeksi siitä, että metyleenisininen poistaa taupatologiaa, sillä eläinkokeiden tulokset eivät tue tätä versiota.

Proteasomihavainto koskee 3xTg-AD-hiiriä, ja se erotti amyloidin tausta

Selkein koe, jossa mittauskohteiden tulokset erkanivat toisistaan, on 16 viikon ruokintatutkimus hiirillä, joilla oli kolme Alzheimerin tautiin liittyvää mutaatiota. Eläimet söivät metyleenisinistä sisältävää rehua kuuden kuukauden iästä alkaen, ja tutkijat mittasivat samanaikaisesti kolmea asiaa: proteasomia, amyloidipitoisuuksia ja tauta.

Proteasomin toiminta muuttui. Kymotrypsiinin kaltainen aktiivisuus kasvoi noin neljänneksen ja trypsiinin kaltainen aktiivisuus noin puolet, kun taas kolmas katalyyttinen aktiivisuus ei muuttunut merkitsevästi. Liukoisen amyloidi-beeta 40:n ja 42:n määrät vähenivät kumpikin noin neljänneksen. Kirjoittajat tulkitsivat tämän lisääntyneeksi poistumiseksi eivätkä vähentyneeksi tuotannoksi, koska esiasteproteiini ja sen pilkkoutumisfragmentit eivät muuttuneet. Lisäksi oppiminen ja muisti paranivat vesilabyrintin koetestissä.

Sitten tulivat toisistaan poikkeavat havainnot. Liukenematon amyloidi ei muuttunut. Plakkivärjäys ei muuttunut. Ihmisen taun kokonaismäärä ja treoniinin 181 kohdalta fosforyloitunut tau eivät muuttuneet, eikä taun poikkeava sijainti muuttunut. Myöskään mitokondrioita koskevat mittaustulokset eivät muuttuneet: sytokromi-c-oksidaasin aktiivisuuteen, oksidaasiproteiiniin tai ATP:hen ei kohdistunut merkitsevää vaikutusta. Tässä mallissa ja tällä annosteluohjelmalla metyleenisininen siis lisäsi kahta proteasomin kolmesta aktiivisuudesta, vähensi liukoista amyloidia ja korjasi käyttäytymismittarilla havaittua häiriötä, mutta jätti taun mittaustulokset, liukenemattoman amyloidin ja tutkitut mitokondrioiden mittaustulokset ennalleen.

Yksi varaus tarkentaa johtopäätöstä heikentämättä sitä. Näille hiirille ei ollut vielä tutkitussa iässä kehittynyt tauaggregaatteja, joten koe ei voi osoittaa, ettei metyleenisininen tehoa taukimppuihin. Se osoittaa, että liukoinen amyloidi voi vähentyä ilman muutoksia mitatuissa taumuuttujissa. Juuri tällaisia tuloksia, joissa yksi proteiini muuttuu ja toinen ei, tämän aiheen käsittelyssä tarvitaan. Jos tulit tänne siinä uskossa, että metyleenisinisen aiheuttama proteasomin aktivaatio poistaa molemmat tunnusomaiset proteiinit yhdessä, tämä tutkimus korjaa käsitystä.

Amyloidin tuotantoa koskeva havainto liittyy ikääntyneisiin PSAPP-hiiriin ja on ristiriidassa edellisen mekanismin kanssa

Eri tutkimusryhmä, eri malli ja päinvastainen selitys tapahtumaketjun alkupäästä. Kolmen kuukauden tutkimuksessa, jossa 15 kuukauden ikäisille PSAPP-hiirille annosteltiin ainetta mahaletkulla, päivittäinen suun kautta annettu 3 mg/kg:n annos vähensi plakkikuormaa eri aivoalueilla noin kolmanneksesta puoleen ja vähensi useita amyloidifraktioita, myös erillisellä määrityksellä mitattuja oligomeerejä. Tässä ehdotettu mekanismi oli kuitenkin vähentynyt tuotanto, ei nopeampi poistuminen: aivojen BACE1-proteiinin määrä väheni ja sen tuotteen C99:n määrä väheni, mutta lähetti-RNA:n määrä ei. Tämä viittaa proteiinitason vaikutukseen eikä vähäisempään geeniekspressioon.

Solukokeet vahvistivat tulkintaa. Rekombinanttientsyymillä tehdyssä soluttomassa määrityksessä metyleenisininen esti suoraan BACE1:tä. Ihmisen amyloidin esiasteproteiinia ilmentävissä hamsterin munasarjasoluissa erittyneen amyloidi 40:n ja 42:n määrät vähenivät jo 1.56 mikromolaarin pitoisuuksilla, kun taas itse esiasteen määrä pysyi ennallaan. Vertaa tätä edelliseen tutkimukseen, jossa esiasteen pilkkoutumisfragmentit eivät muuttuneet ja vaikutus selitettiin poistumisella. Molemmat eivät voi kuvata samaa yleispätevää mekanismia, koska mallit, iät, annokset, antoreitit ja kestot eroavat. Juuri tästä on kyse. Metyleenisinisen vaikutukset amyloidiin välittyvät yhdessä koeasetelmassa tuotannon ja toisessa poistumisen kautta. Kummankin tuloksen lainaaminen ilman koeasetelman kuvausta johtaa harhaan.

Yksi kemia, useita kohteita: kysteiinin hapettuminen yhdistävänä tekijänä

Kolmas tutkimuslinja selittää, miten sama hapetus-pelkistyskemia voi näkyä toisistaan erillisissä proteiineihin liittyvissä havainnoissa. Kaspaasien estoa koskevassa biokemiallisessa tutkimuksessa metyleenisininen inaktivoi kaspaasi-6:n hapettamalla sen katalyyttisen kysteiinin sulfeenihapoksi. Tämä varmistettiin massaspektrometrialla, ja puolimaksimaaliseen vaikutukseen tarvittava pitoisuus oli noin 10.6 mikromolaaria. Kaspaasi-3 estyi samankaltaisella pitoisuudella. Kirjoittajat yhdistivät tämän nimenomaisesti taukirjallisuuteen: sama kysteiiniä hapettava kemia, jonka on ehdotettu pitävän taun monomeerisena, voi inaktivoida kysteiiniproteaasin, ja vaikuttavat pitoisuudet menevät päällekkäin.

Tämä on elegantti selitys, mutta myös varoitus. Hapetus-pelkistysaktiivisella molekyylillä, joka hapettaa paljastuneita kysteiinejä, on millä tahansa vaikuttavalla pitoisuudella useampi kuin yksi kohde. Taun aggregaattien purkautumista, kaspaaseja ja mahdollisesti muitakin kohteita koskevissa havainnoissa kemiallinen tapahtuma on sama, mutta sen kohde eri. Yhteinen tapahtuma ei tee havainnoista keskenään vaihdettavia. Se tarkoittaa, että annos ja olosuhteet ratkaisevat, mikä kohde on olennainen. Lisäksi yhteen kysteiinistä riippuvaiseen prosessiin suunnattu pitkäaikainen annostelu voi vaikuttaa muihinkin prosesseihin, minkä kaspaasitutkimuksen kirjoittajat nostivat suoraan esiin. Myös kysymykset siitä, miten metyleenisinisen hapetus-pelkistyskemia valikoi kohteensa, mitä proteasomin aktivaatio merkitsee muille aggregoituneille proteiineille ja muuttaako pitkäaikainen annostelu kohdeprofiilia, ansaitsevat kukin oman käsittelynsä.

Mekanismi mittauskohteittain: mikä havainto kuuluu mihinkin malliin

Mittauskohde	Taun aggregaatiomääritys (soluton)	3xTg-AD-ruokintatutkimus (16 viikkoa)	PSAPP-mahaletkututkimus (3 kuukautta)	Kaspaasitutkimus (in vitro ja soluissa)
Tau–tau-rakenteiden muodostuminen	Estyi pienillä mikromolaarisilla pitoisuuksilla	Ei arvioitavissa (ei aggregaatteja tässä iässä)	Ei mitattu	Samaa kysteiinikemiaa ehdotettu taulle
Taun kokonaismäärä tai fosforyloitunut tau aivoissa	Ei sovellu	Ei muutosta	Ei mitattu	Ei mitattu
Proteasomin aktiivisuus	Ei mitattu	Kymotrypsiinin kaltainen ja trypsiinin kaltainen aktiivisuus lisääntyivät	Ei mitattu	Ei mitattu
Amyloidin tuotanto (BACE1, C99)	Ei sovellu	Ei muutosta	Väheni (proteiinitason vaikutus, suora esto osoitettu soluttomassa kokeessa)	Ei mitattu
Liukoinen amyloidi	Ei sovellu	Väheni ~26%	Väheni fraktiosta riippuen	Ei mitattu
Liukenematon amyloidi tai plakit	Ei sovellu	Ei muutosta	Väheni 30–56% alueesta riippuen	Ei sovellu
Kognitio	Ei sovellu	Koetestissä havaittu häiriö korjaantui	Käyttäytymisen heikentyminen estyi	Ei sovellu
Mitokondrioita koskevat mittaukset	Ei sovellu	Ei muutosta	Ei tutkimuksen painopiste	Ei mitattu

Lue taulukko rivi riviltä, niin opetus on selvä. Yksikään rivi ei muutu jokaisessa sarakkeessa. Vahvin amyloidin tuotantoa koskeva tulos tulee tutkimuksesta, jossa proteasomia ei tutkittu lainkaan. Vahvin proteasomia koskeva tulos tulee tutkimuksesta, jossa esiasteen pilkkoutuminen ei muuttunut lainkaan. Tauhavainto perustuu pääosin koeputkikokeisiin ja kemiaan, joka kohdistuu myös muihin kuin tavoiteltuihin entsyymeihin. Jokainen, joka yhdistää nämä sarakkeet yhdeksi väitteeksi siitä, että metyleenisininen poistaa patologisia proteiineja kokonaisena luokkana, kirjoittaa katsauksen kokeesta, jota ei koskaan tehty.

Sama tarkkuus koskee potilaita. Se, johtavatko nämä mekanismit kliiniseen hyötyyn, on erillinen kysymys, jolla on omat tutkimuksensa ja johtopäätöksensä. Sitä käsitellään Alzheimerin taudin kliinistä näyttöä koskevassa katsauksessa, ei tässä.