Metyleenisininen ja solujen senesenssi: fibroblastitutkimusten mittarit

Yleinen väärintulkinta etenee näin. Tutkimus raportoi, että metyleenisininen lisäsi viljeltyjen fibroblastien populaation kahdentumisia yli 20:llä, joten lukija päättelee sen poistavan senesenttejä soluja tai pidentävän ihmisen elinikää vastaavasti. Päätelmä tuntuu luontevalta. Se on kuitenkin väärä kahdessa eri kohdassa.

Taustalla oleva ongelma on käsitteellinen, ei numeerinen. Populaation kahdentumiset, senesenssimarkkerit ja telomeerimittaukset vastaavat kukin eri kysymykseen. Metyleenisinistä koskevaa fibroblastitutkimusta on parasta tulkita tutkimuksena senesenssiin siirtymisen viivästymisestä yhdessä solutyypissä viljelymaljalla, ja tulkintaa tukevat mitokondriomittaukset. Tämä on eri asia kuin jo senesenttien solujen valikoiva poistaminen ja edelleen eri asia kuin kokonaisen eliön ikääntyminen. Tämän eron laajempi tausta liittyy siihen, miten mitokondrioiden elektroninsiirto vaikuttaa solujen energiantuotantoon ja miten metyleenisinistä koskevia tutkimusväitteitä tulisi tulkita.

Populaation kahdentumiset kertovat historiasta, eivät nuoruudesta

Useimmat keskeiset tulokset ovat peräisin IMR90-soluista, jotka ovat normaali ihmisen sikiön keuhkofibroblastikanta, jolla on rajallinen jakautumiskyky. Varhaisessa tutkimuksessa metyleenisinisestä ja IMR90-fibroblastien replikatiivisesta eliniästä viljelmiä siirrostettiin aikataulun mukaisesti ja populaation kumulatiiviset kahdentumiset kirjattiin, kunnes viljelmä lakkasi jakautumasta. Nanomolaariset käsittelypitoisuudet, joissa keskeinen pitoisuus oli 100 nM, mahdollistivat yli 20 lisäkahdentumista ennen jakautumisen pysähtymistä.

Populaation kahdentuminen on kirjanpidollinen yksikkö. Se kertoo, kuinka monta kertaa populaatio on suunnilleen kaksinkertaistunut. Se ei suoraan kerro, onko yksittäinen solu senesentti, lepotilassa, erilaistunut vai kuollut. Viljelmään voi kertyä lisää kahdentumisia, koska solut säilyttävät jakautumiskykynsä pidempään, koska harvemman solun jakautuminen pysähtyy varhain stressin vuoksi tai koska olosuhteet suosivat lisääntymiskykyistä alapopulaatiota. Pelkkä määrä ei erota näitä vaihtoehtoja toisistaan.

Siksi kahdentumismääriä tarkastellaan yhdessä markkerien kanssa. Määrä kertoo, kuinka kauan solujen lisääntyminen jatkui. Markkerit kertovat, mihin tilaan jakautumisensa lopettaneet tai eloon jääneet solut siirtyivät.

Mittariopas: mitä kukin markkeri kertoo

Senesenssi soluviljelmässä on fenotyyppi, joka määritetään useiden riippumattomien mittausten perusteella. Mikään yksittäinen värjäys tai proteiini ei todista sitä.

Kasvun pysähtyminen ja DNA-synteesin loppuminen. Pysyvä pysähtyminen varmistetaan vähentyneellä BrdU:n tai EdU:n liittymisellä DNA:han, litteällä solumuodolla ja sillä, etteivät solut ala kasvaa uudelleen uudelleenviljelyn jälkeen. Tämä erottaa senesenssiin liittyvän pysähtymisen tilapäisestä lepotilasta.

Senesenssiin liittyvä beeta-galaktosidaasi. SA-beta-gal-värjäys osoittaa lysosomaalista aktiivisuutta lähellä pH-arvoa 6.0. Senesentit fibroblastit värjäytyvät usein positiivisesti lysosomimassan kasvaessa. Värjäys ei ole spesifinen, joten sitä tulkitaan yhdessä solujen lisääntymisen ja molekyylimarkkerien kanssa.

p16- ja p21-reitit. p16 vaikuttaa CDK4:n ja CDK6:n sekä RB-reitin kautta. p21:n ilmentyminen lisääntyy usein p53:n välityksellä. Pitoisuuksien nousu tukee tulkintaa jakautumisen pysähtymisestä, mutta kumpikaan proteiini ei liity yksinomaan senesenssiin.

Eritystoiminnan tila. Senesenssiin liittyvä eritysfenotyyppi eli SASP tarkoittaa muutoksia sytokiinien, kemokiinien, kasvutekijöiden ja proteaasien vapautumisessa. SASP-tekijöiden RNA- tai proteiinimääritykset kuvaavat, miten solut viestivät naapurisoluilleen. Ne eivät suoraan mittaa jakautumiskykyä.

Hapettavat yhdisteet ja mitokondrioiden mittaustulokset. Metyleenisinistä käsittelevät tutkimukset lisäävät tarkasteluun mitokondrioihin liittyvän tason: kompleksi IV:n määrän ja aktiivisuuden, hapenkulutuksen, hemisynteesin, kalvomassan, kalvopotentiaalin, ATP:n ja hapettavien yhdisteiden signaalit. Ne kuvaavat aineenvaihdunnan tilaa, joka liittyy jakautumisen pysähtymisen viivästymiseen. Ne eivät yksin määritä senesenssiä, mutta niiden avulla testataan ehdotettua mekanismia. Redox-kierron malli, jossa NAD(P)H pelkistää metyleenisinisen ja sytokromi c hapettaa sen uudelleen, esitetään samassa IMR90-tutkimuksessa, joka yhdistää redox-kierron hapettavien yhdisteiden vähäisempään tuotantoon. Tähän liittyviä annostelun ja jakautumisen perusteita käsitellään metyleenisinisen farmakologian ja kudosaltistuksen yhteydessä.

Telomeerien lyhenemisnopeus. Oikea yksikkö on viikkojen aikana menetettyjen emäsparien määrä kahdentumista kohden, ei pituus yhtenä ajankohtana. Hitaampi lyheneminen tarkoittaa vähäisempää lyhenemistä kutakin replikaatiota kohden. Se ei tarkoita pitenemistä, ja stressi voi pysäyttää IMR90-solujen jakautumisen ilman merkittävää telomeerien muutosta.

Kolmen fibroblastitutkimusasetelman vertailu

Tätä sivua varten laadittu vertailu on alla. Se kokoaa solutyypin, altistuksen, mittaukset ja rajoitukset samaan näkymään.

Tutkimus	Solut ja altistus	Mitä mitattiin	Mitä se ei voi osoittaa
Atamna ym., FASEB J 2008	Normaalit IMR90-fibroblastit, pitkäaikainen nanomolaarinen metyleenisinialtistus, 100 nM vakio-olosuhteena	Kumulatiiviset kahdentumiset, kompleksi IV:n määrä, hapenkulutuksen kasvu 37–70 prosentilla, hemisynteesi, vetyperoksidin tai kadmiumin aiheuttaman ennenaikaisen senesenssin torjuminen, vaiheen 2 entsyymit HepG2-soluissa	Senesenttien solujen poistamista ei testattu. Ei eläinten tai ihmisten pitkäikäisyyttä koskevaa päätetapahtumaa. Replikatiivinen elinikä tarkoittaa tässä kahdentumisia viljelymaljalla.
Atamna ym., Redox Biology 2015, kuvattu mekanistisessa jatkotutkimuksessa AMPK:sta ja kompleksi IV:n biogeneesistä	IMR90-fibroblastit, pääasiassa 100 nM metyleenisinistä, vertailuaineena pitkäaikainen AMPK:n aktivaattori AICAR	NAD:n ja NADH:n suhteen ajallinen kehitys, ohimenevä AMPK:n fosforylaatio, PGC-1alpha:n ja SURF1:n ilmentymisen lisääntyminen, kompleksi IV:n aktiivisuuden yli 100 prosentin kasvu, hapettavien yhdisteiden 28 prosenttia pienempi määrä, hitaampi telomeerien lyheneminen, noin 18 lisäkahdentumista verrattuna AICAR:n noin 2:een, ei vaikutusta solusykliin	AICAR-vertailussa annos eroaa noin 1000-kertaisesti ja spesifisyys on erilainen, joten se testaa aktivoitumisen mallia eikä vaikutustehoa vastaavilla annoksilla. Telomeeritulos koskee viikkojen ajan jakautuvia viljelmiä.
Xiong ym., Aging Cell 2016, raportoitu progeriafibroblastitutkimuksessa mitokondrioiden ja tumien muutosten korjaantumisesta	Primaariset Hutchinson–Gilfordin progerian ihofibroblastit ja vastaavat normaalit verrokit, useimmiten 100 nM 5–12 viikon ajan	Mitokondrioiden muoto fluoresenssi- ja elektronimikroskopialla, liikkuvuus elävien solujen kuvantamisella, superoksidi, kalvopotentiaali, ATP, PGC-1alpha, solujen lisääntyminen ja senesenssimarkkerit sekä tumien pullistumat, progeriinin sijainti, heterokromatiini ja geenien ilmentyminen	Sairauskohtainen ennenaikaisen ikääntymisen malli, ei normaali ikääntyminen. Solumuodon ja markkerien korjaantuminen ei ole senesenttien solujen poistamista. Ei eläimissä osoitettua tehoa tai kliinistä päätetapahtumaa.
Xue ym., Cells 2021 -katsaus, tiivistetty katsauksessa metyleenisinisestä mahdollisena ikääntymistä ehkäisevänä yhdisteenä	Yhteenveto aivojen ikääntymistä, neurodegeneraatiota, ihoa, haavan paranemista ja progeriaa käsittelevästä kirjallisuudesta	Esittää metyleenisinisen katalyyttisenä redox-kiertoon osallistuvana yhdisteenä, joka voi ohittaa osia kompleksien I ja III elektroninsiirrosta, ja suhteuttaa tämän ikääntymisen vapaiden radikaalien teorioihin	Vain narratiivinen yhteenveto. Se jäsentää hypoteeseja ja osoittaa, missä kliininen näyttö on edelleen epävarmaa.

Rivien yhteinen kuvio on tärkeämpi kuin mikään yksittäinen rivi. Pieni metyleenisiniannos liittyy toistuvasti pidempään solujen lisääntymisjaksoon, korkeampaan kompleksi IV:n aktiivisuuteen, heikompiin hapettavien yhdisteiden signaaleihin ja parantuneeseen solumuotoon. Asetelma on pitkittäinen: aloitetaan jakautuvista soluista, käsitellään niitä populaation kasvaessa ja kirjataan, kuinka kauan jakautuminen jatkuu. Tällainen rakenne voi tukea väitettä viivästymisestä. Se ei voi tukea väitettä poistamisesta ilman erilaista asetelmaa.

Senesenssin viivästyminen ei ole senesenttien solujen poistamista

Viivästyminen tarkoittaa, että jakautuvat solut jatkavat jakautumistaan pidempään ennen pysähtymistä. Poistaminen, jota usein kutsutaan senolyyttiseksi vaikutukseksi, tarkoittaa jo senesenttien solujen valikoivaa tappamista tai niiden määrän vähentämistä samalla, kun lisääntyvät naapurisolut säilyvät hengissä.

Metyleenisinistä koskeva fibroblastikirjallisuus testaa ensimmäistä asetelmaa. Viljelmät ovat aluksi lisääntyviä, niitä käsitellään peräkkäisten siirrostusten aikana ja niiden jakautuminen pysähtyy myöhemmin. Siksi markkerit, kuten SA-beta-gal, p16, p21 ja SASP-tekijät, ilmaantuvat myöhemmin tai niiden tasot ovat tietyssä siirrostusvaiheessa matalampia. Tämä kuvio on odotettavissa aina, kun senesenssin alku siirtyy. Se ei todista, että yhtään jo senesenttiä solua olisi poistettu.

Senolyyttinen väite edellyttäisi erilaista asetelmaa: ensin viljelmä saatetaan varmennettuun senesenssiin, sitten siihen lisätään yhdistettä ja lopuksi osoitetaan senesenttien solujen valikoiva menetys suhteessa lisääntyviin verrokkisoluihin suorilla elinkelpoisuuden ja solukuoleman mittauksilla. Pelkkä markkerin väheneminen ei riitä, koska ilmentyminen voi muuttua ilman solujen menetystä ja jäljelle jääneet lisääntyvät solut voivat vallata viljelymaljan. Yksikään neljästä viitatusta lähteestä ei käytä metyleenisiniselle tällaista valikoivan vähentämisen asetelmaa, joten täsmällinen nimitys on edelleen senesenssiä viivästyttävä tai senesenssiä ehkäisevä aktiivisuus in vitro, ei senolyyttinen vaikutus. Tämän eron oksidatiiviseen stressiin liittyvää puolta selitetään tarkemmin artikkelissa miten solut säätelevät reaktiivisia happiyhdisteitä.

Ohimenevää signalointia koskeva tulos korostaa tätä eroa. Vuoden 2015 IMR90-tutkimuksessa metyleenisininen aiheutti lyhytaikaisen nousun NAD:n ja NADH:n suhteessa ja lyhytaikaisen AMPK:n fosforylaation, minkä jälkeen PGC-1alpha:n ja SURF1:n ilmentyminen lisääntyi. Molemmat liittyvät kompleksi IV:n biogeneesiin. AMPK:n pitkäaikainen aktivointi AICAR:lla tuotti huomattavasti vähemmän lisäkahdentumisia.

Replikatiivinen elinikä ei ole ihmisen pitkäikäisyyttä

Solun replikatiivinen elinikä tarkoittaa kahdentumisten määrää ennen jakautumisen pysähtymistä kontrolloidulla viljelymaljalla, jossa happipitoisuus, kasvatusliuokset ja siirrostusrytmi ovat vakioituja. Ihmisen pitkäikäisyyteen vaikuttavat vuosikymmenten aikana kehitys, immuunijärjestelmä, verisuonisto, kantasolujen mikroympäristöt, käyttäytyminen ja sairaudet. Yhdiste voi pidentää ensimmäistä vaikuttamatta jälkimmäiseen, ja useimmat tekevät juuri näin.

Progeriafibroblasteissa on tietty LMNA-mutaatio, joka tuottaa progeriinia. Niihin liittyvät pirstoutuneet ja vähemmän liikkuvat mitokondriot, matala ATP-taso, epämuodostuneet tumat ja heterokromatiinin menetys. Nanomolaarinen metyleenisininen paransi mitokondrioiden mittaustuloksia ja korjasi merkittävästi tumia koskevia muutoksia, mukaan lukien progeriinin irtoaminen kalvosta. Tämä on huomattava korjaantuminen solutasolla. Kyse on silti fibroblastituloksesta, ja kirjoittajat esittivät eläinkokeet tulevana tutkimustyönä. Itse sairausmallia käsitellään tarkemmin artikkelissa metyleenisininen progerian ja ennenaikaisen ikääntymisen malleissa.

Tästä voidaan johtaa käytännöllinen tarkistuslista tutkimusten lukemiseen.

Kysy, alkoiko käsittely ennen jakautumisen pysähtymistä vai sen vakiinnuttua. Ennen aloitettu käsittely tukee viivästymistä. Poistamisen osoittamiseen tarvitaan pysähtymisen jälkeen aloitettu käsittely sekä tietoa valikoivasta solukuolemasta.
Kysy, miten verrokin kahdentumiskäyrä kehittyi. Ilman kumulatiivisia kahdentumisia markkerimuutoksilta puuttuu vertailukehys.
Pyydä vähintään kahta markkeriluokkaa, kuten solujen lisääntymistä osoittavaa merkintää sekä p16:ta tai p21:tä ja SA-beta-gal-värjäystä, pelkän yhden värjäyksen sijaan.
Kysy, miten telomeerit raportoitiin. Ajassa seurattu nopeus kahdentumista kohden on merkityksellinen. Yksittäinen pituusmittaus ei ole.
Kysy, mitkä tekijät pidettiin vakioina. Siirrostustiheys, happipitoisuus, kasvatusliuosten vaihdot sekä tuoreet tai vanhentuneet metyleenisinisen kantaliuokset vaikuttavat kaikki fibroblastien jakautumisen pysähtymiseen.

Näin luettuna fibroblastikirjallisuus antaa metyleenisiniselle johdonmukaisen mutta rajatun roolin: se on pieninä annoksina käytetty redox-aktiivinen yhdiste, joka viivästyttää replikatiivista senesenssiä viljellyissä ihmisen fibroblasteissa ja parantaa samalla mitokondrioiden mittaustuloksia. Vahvimmat mekanistiset yksityiskohdat koskevat ohimenevää energiasignalointia ja kompleksi IV:n biogeneesiä, eikä näissä tutkimuksissa ole osoitettu senesenttien solujen poistumista tai ihmisen eliniän pitenemistä.