Metyleenisininen ja näkö: mitä verkkokalvotutkimus osoittaa ja missä sen rajat kulkevat

Lukija löytää tutkimuksen, jossa metyleenisininen suojasi verkkokalvoa, ja esittää sitten luontevan kysymyksen: pitäisikö sitä laittaa silmään? Metyleenisinisen ja näön tutkimus ei vastaa tähän kysymykseen, sillä yksikään keskeisistä tutkimuksista ei testannut tällaista käyttöä. Yhdessä väriainetta injektoitiin hiirten lasiaiseen yhdessä toksiinin kanssa. Toisessa sitä lisättiin maljalla eristettyjä soluja ympäröivään kasvatusliuokseen. Kolmannessa sitä lisättiin mutanttihiirten juomaveteen. Kukin tulos koskee omaa antoreittiään ja malliaan.

Tässä artikkelissa käydään läpi kolme prekliinistä tutkimusta, kaksi verkkokalvon solutyyppiä sekä laboratoriossa havaitun suojan ja kliinisen silmähoidon välinen raja. Kokonaiskuva on johdonmukainen: metyleenisininen voi muuttaa verkkokalvon solujen mitokondriaalista stressiä kontrolloiduissa olosuhteissa, eikä tämä havainto oikeuta vähittäismyyntiliuosten laittamista silmään.

Kaksi solutyyppiä, kaksi eri sairautta

Verkkokalvo koostuu kerroksista, ja kerroksella on merkitystä. Valo osuu ensin verkkokalvon ulko-osan valoreseptoreihin. Niiden signaalit kulkevat välittävien hermosolujen kautta verkkokalvon sisäosan gangliosoluihin, joiden aksonit poistuvat silmästä näköhermon kautta. Alla oleva kaavio nimeää kerrokset järjestyksessä.

Verkkokalvon gangliosolut ovat soluja, jotka ovat vaarassa glaukoomassa ja optikusneuropatiassa. Kun hauissa mainitaan metyleenisininen ja glaukooma, niillä tarkoitetaan yleensä tätä sisempää kerrosta ja sen aksoneita. Valoreseptorit puolestaan ovat vaarassa verkkokalvon ulko-osan rappeutumisessa. Niiden energiantarve on verkkokalvon suurin, ja ne toimivat lähellä soluhengityksensä kapasiteettirajaa. Siksi niillä on vain vähän varakapasiteettia, kun mitokondrioiden kompleksi I pettää. Yhtä solutyyppiä koskeva tulos ei siirry toiseen, ja alla esitellyt kolme tutkimusta pitävät ne erillään. Mallien ja johtopäätösten erottamista toisistaan käsitellään yleisemmin artikkelissa miten metyleenisinistä koskevaa tutkimusta luetaan.

Gangliosolut elävän hiiren silmässä

Näistä kolmesta varhaisimmassa tutkimuksessa tutkijat mallinsivat optikusneuropatiaa mikroinjektoimalla rotenonia hiiren toisen silmän lasiaiseen ja käyttivät toista silmää liuotinkontrollina. Rotenoni estää mitokondrioiden kompleksia I, joka on elektroneja NADH:lta eteenpäin siirtävä sisääntulokohta. Kompleksin I toimintahäiriö on myös piirre, joka yhdistää tämän mallin Leberin perinnölliseen optikusneuropatiaan, gangliosolujen ja näköhermon sairauteen.

Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin rotenonilla käsiteltyjen silmien gangliosolukerros oli ohuempi ja sisälsi vähemmän soluja kuin kontrollisilmien kerros. Kun metyleenisinistä injektoitiin yhdessä rotenonin kanssa, vaurio estyi annosriippuvaisesti. Suurin testattu annos (0.07 mg/kg, selvästi hiiren LD50-arvoa pienempi) säilytti sekä kerroksen paksuuden että solumäärät. Rinnakkaiset kokeet aivohomogenaateilla osoittivat kaksi vaikutusta: metyleenisininen kumosi rotenonin aiheuttaman oksidatiivisen stressin ja hapenkulutuksen vähenemisen. Kirjoittajat ehdottivat eksitotoksista mekanismia, jossa rotenoni vaurioittaa toimintaa sääteleviä amakriinisoluja, gangliosolut aktivoituvat liiallisesti ja antioksidanttivaikutus katkaisee tästä seuraavan vaurioitumisen. Tämän suojan taustalle ehdotettua kemiaa käsitellään tarkemmin artikkelissa metyleenisinisen mitokondriaaliset mekanismit.

Tulokseen liittyy kolme rajoitusta. Väriaine injektoitiin yhdessä toksiinin kanssa suoraan silmään, mikä on antotapa, ei hoitoaikataulu. Havainnointijakso oli 24 tuntia. Lisäksi sytokromioksidaasin mittausarvot nousivat molemmissa vaurioituneissa ryhmissä. Kirjoittajat tulkitsivat tämän yliaktiivisuudeksi, eivät todisteeksi soluhengityksen palautumisesta elävässä verkkokalvossa.

Maljalle eristetyt gangliosolut

Toisessa tutkimuksessa silmä jätettiin kokonaan pois. Tutkijat eristivät nuorista rotista primaarisia verkkokalvon gangliosoluja ja altistivat ne rotenonille, apoptoosia käynnistävälle staurosporiinille tai vähähappisille oloille 72 tunnin ajan. Tämän jälkeen he mittasivat elossa säilymistä elävät ja kuolleet solut erottavalla värjäyksellä. Metyleenisininen kasvatusliuoksessa 1 ja 10 mikromolaarin pitoisuuksina paransi elossa säilymistä kunkin haitallisen altistuksen yhteydessä noin 1.5–1.9-kertaiseksi olosuhteesta riippuen. Rinnakkainen koe osoitti, että metyleenisininen säilytti sytokromi-c-oksidaasin aktiivisuuden vetyperoksidialtistuksen aikana.

Kyse on eristettyjen solujen farmakologiasta. Yhdiste saavutti solut diffundoitumalla kasvatusliuoksen läpi määritellyssä pitoisuudessa. Välissä ei ollut sarveiskalvoa, kyynelkalvoa, mykiötä, lasiaista, verenkiertoa eikä immuunijärjestelmää. Tämä yksinkertaisuus on mallin tarkoitus: se osoittaa, että gangliosoluja itsessään voidaan suojata, kun yhdiste saavuttaa ne. Se ei kerro mitään siitä, voisiko sarveiskalvon pinnalle annettu tippa tuottaa jonkin määritellyn pitoisuuden verkkokalvon sisäosaan. Yli 10 mikromolaarin pitoisuuksia vältettiin niiden samoihin soluihin kohdistuvan toksisuuden vuoksi. Tämä muistuttaa siitä, että annosvaste maljalla voi kulkea kumpaankin suuntaan.

Valoreseptorit mutanttihiirissä ja solulinjassa

Kolmas tutkimus koskee verkkokalvon ulko-osaa. Tutkijat käyttivät Harlequin-hiiriä, joilla apoptoosia indusoivan tekijän puutos jättää kompleksin I epätäydellisesti kokoonpannuksi. He tutkivat valoreseptorien rakennetta, ulkojäsenen merkkiaineita ja mitokondrioiden eheyttä 11 kuukauden iässä. Metyleenisinistä annettiin systeemisesti juomavedessä vieroituksen jälkeen noin 10 mg/kg vuorokaudessa. Hoidetuilla mutanttihiirillä verkkokalvon paksuus säilyi paremmin, rodopsiini- ja opsiinimerkkiaineita oli enemmän ja mitokondrioiden rakenne oli terveempi kuin hoitamattomilla mutanttihiirillä.

Rinnakkaisessa solututkimuksessa käytettiin 661W-soluja, immortalisoitua hiiren valoreseptorin kaltaista solulinjaa. Solut altistettiin rotenonille joko metyleenisinisen kanssa tai ilman sitä 24 tunnin ajan. Elossa säilyminen parani 30 mikromolaarin pitoisuudessa, ja pienemmät pitoisuudet normalisoivat NADH:n ja NAD+:n suhdetta sekä vähensivät oksidatiivista stressiä. Huomionarvoista on se, mitä metyleenisininen ei tehnyt: se ei palauttanut ATP:tä. Suoja liittyi hapetus-pelkistysstressin lievittymiseen ja stressireittien vaimenemiseen, mukaan lukien mitokondrioiden laskostumattomien proteiinien vaste ja mitofagian merkkiaineet, ei energiansaannin palautumiseen.

Tämä ero on tärkeä metyleenisinistä ja verkkokalvoa koskevien väitteiden kannalta. Yhdiste voi pitää stressaantuneen valoreseptorin elossa korjaamatta sen energiavajetta. Siksi mahdollinen hoidollinen tulkinta rajautuu hapetus-pelkistysstressiin eikä laaja-alaiseen uudistumiseen.

Kolme tutkimusta rinnakkain

Alla olevassa vertailussa kukin tutkimus eritellään mallin ja antoreitin mukaan, koska nämä kaksi saraketta määräävät, mitä tulos voi tukea.

Jokainen rivi koskee prekliinistä tutkimusta. Yhdessäkään tutkimuksessa ei ollut potilaita, mitattu näköä eikä testattu silmälääkemuotoa.

Miksi tämä ei ole glaukooman hoitoa

Glaukooman hoidossa alennetaan silmänpainetta. Neuroprotektio pyrkii johonkin muuhun: pitämään gangliosolut ja niiden aksonit elossa stressin aikana. Yllä kuvatut tutkimukset kuuluvat jälkimmäiseen tavoitteeseen, eivät ensimmäiseen. Yksikään niistä ei alentanut silmänpainetta, eikä yhdessäkään verrattu metyleenisinistä silmänpainetta alentavaan hoitoon. Siksi vakiintuneet glaukooman hoito- ja silmänpaineen hallintakeinot ovat eri kysymys kuin hapetus-pelkistysmekanismeihin perustuva neuroprotektio, eikä solujen elossa säilymistä koskevaa tulosta voi tulkita näön säilymiseksi.

Antoreittien erot vahvistavat tätä eroa. Lasiaisensisäinen yhteisinjektio sijoittaa tunnetun määrän verkkokalvon viereen vaurion syntyhetkellä. Juomavedessä annostelu altistaa koko eläimen kuukausien ajan, mutta verkkokalvon pitoisuus jää tuntemattomaksi. Kasvatusliuos altistaa paljaat solut suoraan. Mikään näistä ei ennusta, mikä osuus paikallisesti annetusta annoksesta läpäisisi sarveiskalvon, säilyisi kyynelnesteen huuhtovasta vaikutuksesta huolimatta, kulkisi mykiön ja lasiaisen läpi ja saavuttaisi jommankumman verkkokalvokerroksen hyödyllisessä pitoisuudessa. Tämä kulkeutumisongelma on osa laajempaa kysymystä metyleenisinisen antoreiteistä ja jakautumisesta, jossa jokainen antoreitti tarvitsee omat pitoisuusmittauksensa.

Kudosten erot muodostavat toisen esteen. Silmän etuosaan päätynyt väriaine ei ole vielä saavuttanut silmän takaosaa, ja yhtä kerrosta hyödyttävä pitoisuus voi vaurioittaa toista. Vähittäismyyntiliuoksia ei valmisteta, steriloida, puskuroida eikä varusteta säilöntäaineilla silmävalmisteiden vaatimusten mukaisesti. Puhtaus, pH, osmolaliteetti ja apuaineet ovat kaikki tärkeitä sarveiskalvon ja silmänsisäisten kudosten altistuksen kannalta. Mikään näissä verkkokalvoa koskevissa löydöksissä ei tue tällaisten liuosten laittamista silmän sisään tai sen pinnalle. Valmisteita koskevat laatukysymykset kuuluvat metyleenisinisen turvallisuuden ja käsittelyn yhteyteen.

Missä näytön rajat kulkevat

Yhdessä luettuina nämä kolme tutkimusta tukevat rajattua väitettä: kontrolloiduissa olosuhteissa metyleenisininen voi lievittää verkkokalvon hermosolujen mitokondriaalista hapetus-pelkistysstressiä ja säilyttää niiden rakennetta. Väite ulottuu vain niihin olosuhteisiin, joissa se on osoitettu. Toksiiniin tai perinnölliseen kompleksin I vikaan perustuvat mallit eivät vastaa glaukoomaa, drusen-kertymiä tai diabetekseen liittyvää sairautta. Lyhyet seurantajaksot ja rakenteelliset päätetapahtumat eivät ole sama asia kuin näön pitkäaikainen säilyminen. Eikä yhdessä kudostilassa suojaava pitoisuus ole annos toiseen.

Vahvempi näyttö vaatisi erillisiä osatekijöitä: määritellyn verkkokalvoaltistuksen kliinisesti käyttökelpoisen antoreitin jälkeen, toiminnallisia näön päätetapahtumia eläimillä, silmänpaineesta riippumattoman hyödyn glaukooman kannalta merkityksellisessä mallissa ja sen jälkeen ihmisillä saatua turvallisuus- ja tehotietoa. Ennen kuin näitä on, metyleenisinisen ja näön yhteys pysyy selkeästi rajattuna tutkimushypoteesina: uskottavaa mitokondriaalista farmakologiaa verkkokalvossa, osoitettuna vain soluissa ja eläimissä, ilman että näistä tutkimuksista olisi tietä silmien hoitamiseen.