Metyleenisininen ja MS-tauti: mitä eläintutkimuksissa testattiin

Kun etsit tietoa metyleenisinisen käytöstä MS-taudissa, löydät tutkimusartikkeleita, jotka näyttävät vastaavan samaan kysymykseen. Näin ei kuitenkaan ole. Yhdessä tutkimuksessa metyleenisinistä annettiin sairaille hiirille hoitona. Toisessa sillä ei hoidettu yhtäkään eläintä. Siinä metyleenisinistä käytettiin sinisenä väriaineena ohuissa selkäydinleikkeissä, jotta patologi saattoi tarkastella myeliiniä mikroskoopilla.

Tämä erottelu on koko artikkelin lähtökohta. Väriaineella on biologiassa kaksi roolia, joilla ei ole muuta yhteistä kuin pullo. Lääke-ehdokkaana sitä annostellaan elävälle eläimelle, ja kysymys on siitä, muuttuuko sairaus. Väriaineena sitä levitetään kuolleeseen, kiinnitettyyn kudokseen kokeen jälkeen, ja kysymys on siitä, miltä kudos näytti. Jos tämä ero jää huomaamatta, patologian menetelmäosiota voi erehtyä lukemaan hoitotuloksena.

Mitä EAE tarkoittaa yksinkertaisesti selitettynä

Kokeellinen autoimmuunienkefalomyeliitti, tavallisesti lyhennettynä EAE, on vakiintunut eläinmalli MS-taudin tiettyjen piirteiden tutkimiseen. Tutkija immunisoi alttiin hiiren myeliiniproteiinin osalla ja voimakkaalla adjuvantilla. Immuunijärjestelmä alkaa sitten hyökätä eläimen omaa keskushermostoa vastaan. Hiirelle kehittyy ylöspäin etenevää heikkoutta, jota on helppo pisteyttää asteikolla 0–5, velttoudesta hännässä takaraajojen halvaantumiseen.

Pisteytyksen helppous selittää sekä EAE:n suosiota että sitä, miksi se voi johtaa harhaan. Ihmisen MS-tauti syntyy itsestään, kohdistuu laajempaan ja vähemmän tarkasti määriteltyyn kohdejoukkoon ja aiheuttaa näköön, tuntoaistiin, tiedonkäsittelyyn, pikkuaivojen toimintaan ja liikkeisiin liittyviä oireita aaltomaisessa tai etenevässä taudinkulussa. EAE jäljittelee valikoituja mekanismeja, kuten tulehdusta, demyelinaatiota ja aksonivaurioita, hallituissa olosuhteissa. Se ei ole MS-tauti pienoiskoossa. Yleiskuvaa kaipaavat lukijat voivat perehtyä siihen, miten metyleenisinisen ajatellaan vaikuttavan solutasolla, ennen kuin arvioivat yksittäistä sairauteen liittyvää väitettä.

Alla käsitellyissä kahdessa tutkimuksessa käytettiin myös eri EAE-antigeenejä, mikä on olennaista. Hoitotutkimuksessa sairaus indusoitiin MOG35-55:llä, joka on lyhyt peptidi myeliinin oligodendrosyyttiglykoproteiinista. Patologiatutkimuksessa sairaus indusoitiin MP4:llä, joka on myeliinin emäksisen proteiinin ja proteolipidiproteiinin osista muodostettu fuusioproteiini. Hiirikannan ja antigeenin valinta vaikuttaa siihen, missä vaurioita esiintyy ja miten tulehdus käyttäytyy, joten tutkimukset eivät ole saman kokeen kaksi toistoa.

Kartta: mallista kysymykseen ja rajoihin

Pidä tämä taulukko esillä. Se toimii tämän artikkelin keskeisenä vertailukohtana. Jokaisella rivillä kerrotaan, mihin kliiniseen kysymykseen malli voi vastata, mitä todella mitattiin ja missä tulosten soveltamisen raja kulkee.

Seuraavan otsikon väitteitä tarkistava lukija voi käyttää samoja sarakkeita prekliinisten tutkimusten lukuoppaan avulla: selvitä eläinlaji ja antigeeni, yhdisteen rooli, vastemuuttujat sekä se, kuvaako tulos taudinkulkua vai kudoksen tilaa tiettynä hetkenä.

Hoitotulos: mitä annostelu muutti

Journal of Neuroimmunology -lehdessä julkaistussa vuoden 2016 hoitotutkimuksessa käytettiin noin 8–10 viikon ikäisiä C57BL/6-naarashiiriä, jotka immunisoitiin 250 mikrogrammalla MOG35-55:tä hiirtä kohden. Induktion jälkeen EAE-eläimet satunnaistettiin metyleenisinistä saavaan ryhmään tai hoitamattomaan EAE-ryhmään, ja kliinisiä pisteitä seurattiin noin päivään 30 asti.

Hoidettujen hiirten kliiniset pisteet olivat merkitsevästi pienempiä kuin EAE-verrokkien päivästä 15 päivään 30, P-arvon ollessa alle 0.01. Selkäytimen analyysi osoitti samaan suuntaan: hoidetuilla eläimillä oli vähemmän tulehdussolujen infiltraatiota, demyelinaatiota ja aksonikatoa.

Tutkimuksen erottuva osa oli signalointimittauksien kokonaisuus. Hoito lisäsi AMPK:n aktivaatiota ja SIRT1:n ilmentymistä sekä vaimensi NF-kB:n aktivaatiota, joka on keskeinen tulehduksen säätelijä. Hankitun immuniteetin osalta se vähensi Th17-vastetta ja vahvisti Treg-vastetta. Ehdotettu tapahtumaketju etenee siis metyleenisinisestä AMPK:hon ja SIRT1:een, vähäisempään NF-kB-signalointiin, siirtymään tulehdusta edistävästä Th17-vasteesta kohti säätelevää Treg-vastetta, lievempään kudosvaurioon ja pienempiin pisteisiin.

Tämä ketju on tulkinta, ei todistettu syy-seuraussuhteiden sarja. Tutkimuksessa lääke, signaloinnin muutokset ja sairauden lievittyminen esiintyvät yhdessä. Se ei todista, että AMPK ja SIRT1 välittäisivät koko hyödyn, eikä julkisesti indeksoitu teksti esitä tarkkaa milligrammaa kilogrammaa kohden -annosta, antoreittiä, aloituspäivää tai kestoa niin selkeästi, että hoitoasetelman voisi toistaa pelkän tiivistelmän perusteella. Suhtaudu myyntisivuilla tämän tutkimuksen yhteydessä esitettyihin annoslukuihin varmentamattomina, ellei niiden lähteenä ole kokotekstin menetelmäosio. Metyleenisinistä koskevasta laajemmasta ihmistutkimusnäytöstä kannattaa tarkistaa, johtiko tämä varhainen immuunisignalointia koskeva havainto koskaan kliiniseen tutkimustietoon.

Patologiatulos: mitä kuuden kuukauden kudosnäytteet osoittivat

PLoS ONE -lehdessä julkaistussa vuoden 2015 MP4-tutkimuksessa käytettiin C57BL/6-naarashiiriä, jotka immunisoitiin 200 mikrogrammalla MP4:ää täydellisessä Freundin adjuvantissa. Lisäksi annettiin pertussistoksiinia immunisointipäivänä ja uudelleen 48 tuntia myöhemmin. Yksikään eläin ei saanut metyleenisinistä lääkkeenä. Kiinnityksen ja valamisen jälkeen yhden mikrometrin paksuiset poikittaiset selkäydinleikkeet värjättiin metyleenisinisellä valomikroskopiaa varten. Tarkempia yksityiskohtia tutkittiin ventrolateraalisen radan elektronimikroskopialla.

Kudosnäytteitä otettiin kolmessa vaiheessa: akuutissa huippuvaiheessa 7 hiireltä, kolme kuukautta oireiden alkamisen jälkeen 5 hiireltä ja kuusi kuukautta oireiden alkamisen jälkeen 10 hiireltä. Keskimääräiset kliiniset pisteet näyttivät näissä vaiheissa lähes samoilta, noin 1.7–1.8 asteikolla 0–5. Kudos kertoi toisenlaisen tarinan. Pelkästään myeliinivaurioita sisältävien säikeiden määrä kasvoi akuutin huippuvaiheen noin 569,000 säikeestä neliömillimetriä kohden noin 1,496,000 säikeeseen kuuden kuukauden kohdalla. Akuutin vaiheen ja pitkän aikavälin vertailu oli merkitsevä, P-arvon ollessa 0.027. Yhdistetyt myeliini- ja aksonivauriot suunnilleen kaksinkertaistuivat kuuteen kuukauteen mennessä. Uudelleen myelinisoituvien säikeiden osuus pysyi alle yhdessä prosentissa jokaisessa vaiheessa, mikä on hillitsevä yksityiskohta korjautumiseen kohdistuvien odotusten kannalta.

Aksonivauriot noudattivat U:n muotoista kehityskulkua: niitä oli paljon akuutissa huippuvaiheessa, vähemmän kolmen kuukauden kohdalla ja eniten kuuden kuukauden kohdalla. Ne korreloivat mitokondrioiden turpoamisen ja neurofilamenttien välisten etäisyyksien pienenemisen kanssa. Arvioijat oli sokkoutettu kliinisille pisteille ja tutkimusvaiheelle, mikä vahvistaa tulkintaa siitä, että kliiniset pisteet aliarvioivat jatkuvaa rakenteellista vauriota.

Tämä ristiriita on tutkimuksen varsinainen anti MS-taudista kiinnostuneelle lukijalle. Vakaa toimintakyvyn haittaa kuvaava pistemäärä ei tarkoittanut kudoksen vakaata tilaa. Se myös osoittaa, miksi tällä tutkimuksella ei voi perustella mitään väitettä metyleenisinisen käytöstä MS-taudin hoitona. Siinä tutkittiin aikaa, ei hoitoa.

Miksi kumpikaan tutkimus ei osoita hyötyä potilaille

Kumpikin tutkimus vastaa hyvin rajattuun kysymykseen mutta ei lainkaan kysymykseen potilaiden saamasta hyödystä.

Ensinnäkin syntymekanismi on erilainen. EAE käynnistetään tarkoituksella määritellyllä antigeenillä ja adjuvantilla. Ihmisen MS-tauti kehittyy spontaanisti, ja siihen osallistuu laajempi immuunitoimintojen joukko, johon kuuluvat T-solut, B-solut, synnynnäinen immuniteetti ja kudoksessa pysyvästi olevat gliasolut. Yhdiste, joka muuttaa hiiren MOG-painotteista vastetta, ei välttämättä muuta tätä laajempaa ihmisen vastetta.

Toiseksi fenotyyppi on erilainen. Hiiren hännästä takaraajoihin etenevä heikkous on kätevä mittari. Se tiivistää ihmisen MS-taudin monimuotoisuuden yhdeksi motoriseksi luvuksi. Lääkkeet muuttavat usein lyhyen aikavälin EAE-pisteitä muuttamatta ihmisen taudinkulkua. Siksi EAE on seulonnan ja mekanismien tutkimisen väline, ei pienoisklinikka.

Kolmanneksi altistus ja ajoitus ovat selvittämättä. Varhain aloitettu jatkuva annostelu 30 päivän hiirikokeessa ei vastaa pitkäaikaista suun kautta tapahtuvaa käyttöä ihmisellä, jolla sairaus on jo vakiintunut. Kummassakaan tutkimuksessa ei myöskään mitattu lääkepitoisuuksia hermostossa. Ilman tätä yhteyttä ei ole siltaa viljelymaljan pitoisuudesta tai hiiren annoksesta ihmisen hoito-ohjelmaan.

Neljänneksi nämä kaksi tutkimusta eivät toista toistensa tuloksia. Niissä on eri antigeenit, eri kysymykset ja eri vastemuuttujat, ja toisessa ei testattu hoitoa lainkaan. Niiden siteeraaminen yhdessä kahtena myönteisenä MS-taudin hoitotutkimuksena on kategoriavirhe.

Mitä tämä tarkoittaa näyttöä arvioiville lukijoille

Näissä tutkimuksissa ei ole vakiintunutta metyleenisinisen hoitokäytäntöä MS-tautiin. Hoitotutkimus tukee AMPK:n, SIRT1:n, NF-kB:n sekä Th17:n ja Treg:n välisen tasapainon jatkotutkimusta MOG-EAE:ssä. Patologiatutkimus muistuttaa, että kudosvaurio voi edetä pisteiden pysyessä ennallaan ja että menetelmäosiossa mainittu metyleenisininen tarkoittaa joskus väriainepurkkia eikä lääkekaappia. Käynnissä olevaa MS-taudin tutkimusta seuraavien lukijoiden kannattaa pitää mielessä tämä ero väriaineen ja lääkkeen välillä. Turvallisuuskysymyksistä, myös vereen liittyvistä riskeistä ja yhteisvaikutuksista, tulee keskustella lääkärin kanssa yhdessä metyleenisinisen yleisten turvallisuustietojen kanssa ennen kuin laboratoriotutkimusten otsikoiden perusteella ryhdytään toimimaan.

Ydinviesti mahtuu yhteen lauseeseen. Yhdessä siteeratussa tutkimuksessa metyleenisinistä annosteltiin MOG-EAE-hiirille ja raportoitiin lievempi sairaus sekä tulehdusta vähentävä muutos immuunivasteessa, kun taas toisessa siteeratussa tutkimuksessa ei annosteltu mitään ja metyleenisinistä käytettiin vain selkäytimen värjäämiseen samalla kun dokumentoitiin kuuden kuukauden aikana kertyviä myeliini- ja aksonivaurioita, joten nämä kaksi tutkimusta eivät osoita metyleenisinisen auttavan ihmisen MS-taudissa.