Metyleenisininen ja ferroptoosi: rauta, lipidiperoksidaatio ja solukuolema

Ferroptoosi on kalvovaurion aiheuttama solukuolema. Kalvojen monityydyttymättömät rasvat hapettuvat ketjureaktiossa, kalvo menettää toimintakykynsä ja solu kuolee. Reaktion kemia edellyttää rautaa. Tässä lauseessa on koko käsite, ja kaikki tässä artikkelissa käsitellyt kokeet testaavat jotakin sen osaa.

Tässä kysymys on rajatumpi: mitä metyleenisininen tekee tälle ketjulle solukokeissa ja mitä tulos oikeastaan osoittaa? Lyhyt vastaus on, että kahdessa laboratoriotutkimuksessa nanomolaarinen metyleenisininen vähensi mitokondrioiden lipidiperoksidaatiota ja piti solut elossa sellaisten käsittelyjen jälkeen, jotka muuten aiheuttavat ferroptoosia. Pidempi vastaus on tärkeämpi, sillä ketjun jokaista lenkkiä testattiin eri interventiolla, ja jokaisella interventiolla on rajoituksensa.

Ferroptoosi yhdessä kappaleessa

Kalvon fosfolipidillä, jonka häntänä on monityydyttymätön rasvahappo, on heikko kohta: vetyatomit, jotka on helppo riistää. Kun radikaali riistää yhden niistä, happea liittyy lipidiin, syntyy lipidiperoksyyliradikaali, ja tämä radikaali riistää vetyatomin seuraavalta lipidiltä. Reaktio etenee kalvoa pitkin, ellei jokin pysäytä sitä.

Tärkein pysäyttäjä on GPX4-niminen entsyymi, joka pelkistää glutationin avulla lipidiperoksidit vaarattomiksi lipidialkoholeiksi. Laboratoriossa käytettävät laukaisijat kohdistuvat tämän puolustuksen tiettyihin kohtiin. Erastiini estää kystiinin sisäänoton xc-miinus-järjestelmän kautta, jolloin solulta puuttuu glutationisynteesiin tarvittavaa kysteiiniä. Butioniinisulfoksimiini estää glutationisynteesiä suoraan. RSL3 estää itse GPX4:n toimintaa. Kaikki kolme jättävät peroksidit poistamatta, mutta ne tekevät sen eri vaiheissa, joten yhdellä laukaisijalla saatu tulos ei automaattisesti päde muihin.

Ferroptoosi eroaa apoptoosista sitä määrittävien ominaisuuksien osalta. Siihen ei kuulu kaspaasikaskadia eikä apoptoottisia kappaleita. Rautakelaattorit, kuten deferoksamiini, ja radikaaleja sitovat aineet, kuten ferro statiini-1, estävät sitä. Tutkijat käyttävät tätä toiminnallisena testinä erottaakseen ferroptoottisen kuoleman pelkästään nekroottisesta kuolemasta. Säädeltyjen solukuolemareittien laajempi kokonaisuus auttaa ymmärtämään tätä eroa, ja solujen tapa käsitellä labiilia rautaa selittää, miksi kelatointi on niin ratkaiseva kontrolli.

Mitokondrioiden rooli ja miksi siitä kiisteltiin

Varhaisissa tutkimuksissa raportoitiin, että myös solut, joilla ei ole mitokondriaalista DNA:ta, voivat kuolla ferroptoosin kautta. Tämä viittasi siihen, etteivät mitokondriot ole välttämättömiä. Myöhemmissä tutkimuksissa havaittiin, että mitokondrioiden vähentäminen tai soluhengityksen estäminen voi estää kysteiinin puutteen aiheuttamaa ferroptoosia, mutta ei suoran GPX4-eston aiheuttamaa ferroptoosia. Molemmat tulokset voivat pitää paikkansa, jos mitokondrioiden osuus riippuu laukaisijasta, solutyypistä ja siitä, missä ratkaiseva peroksidaatio tapahtuu.

Tämän artikkelin keskeinen tutkimus lähestyi kiistaa tiettyyn solun osastoon kohdistetulla koettimella. MitoCLox on mitokondrioihin kohdistettu lipidiperoksidaation reportteri: sen fluoresenssi muuttuu, kun se kohtaa lipidiperoksyyliradikaaleja mitokondrioiden sisällä. Erastiinilla käsitellyissä fibroblasteissa mitokondriaalisen koettimen hapettumista ilmeni vielä elävissä soluissa ennen kuolemaa, ja hapettuminen vaihteli solupopulaation sisällä. Ajoituksella on merkitystä. Kuolemaa edeltävä peroksidaatio voi olla sen syy. Vain kuolleista soluista mitattu peroksidaatio kertoo jäänteistä. Täydentävä opas lipidiperoksidaation määritysmenetelmistä ja siitä, mitä kukin koetin osoittaa käsittelee sitä, miksi koettimen sijainti ratkaisee signaalin merkityksen.

Sama kuvio ilmeni toisessa mallissa. Leberin perinnöllistä näköhermosurkastumaa sairastavan potilaan fibroblastit, joissa on kompleksi I:n mutaatio ja tavallista suurempi oksidatiivinen stressi jo lähtötilanteessa, kuolivat ferroptoosin kautta glutationin ehtyessä, kun taas kontrollifibroblastit kestivät käsittelyn. Mitokondriaalisen koettimen hapettuminen tapahtui jälleen ensin. Yksityiskohdat löytyvät fibroblastitutkimuksesta, jossa tarkasteltiin mitokondrioiden lipidiperoksidaatiota ferroptoosissa.

Mitä metyleenisininen muutti näissä kokeissa

Metyleenisininen on redox-välittäjä. Sen hapettunut muoto vastaanottaa elektroneja NADH:hon kytkeytyvistä reaktioista kompleksi I:ssä, ja sen pelkistynyt muoto luovuttaa ne sytokromi c:lle, joka syöttää elektroneja kompleksi IV:lle. Näin syntyy osittainen ohitus ketjun sen osan ympäri, jossa elektronit tavallisesti vuotavat hapelle ja muodostavat superoksidia. Koko elektroninsiirtoketjusta kiinnostuneiden kannattaa aloittaa artikkelista miten metyleenisininen siirtää elektroneja mitokondrioissa.

Erastiinilla käsitellyissä keuhkofibroblasteissa metyleenisininen säilytti solujen elinkelpoisuuden 250 nanomolaarisena pitoisuutena solujen selviytymistä mittaavassa kokeessa, samoin kuin mitokondrioihin kohdistetut antioksidantit SkQ1 ja MitoTEMPO. Kontrollit rajaavat väitteen. Myös ferrostatiini-1, alfa-tokoferoli ja deferoksamiini suojasivat soluja, mikä vahvistaa kuoleman olleen ferroptoottinen. SkQ1:n analogi, josta puuttui antioksidanttiryhmä, ei suojannut soluja. Tämä viittaa redox-kemiaan eikä epäspesifiseen kertymiseen. Suoja heikkeni SkQ1:n pitoisuuden ylittäessä noin 200 nanomolaaria, mikä vastaa kinoniantioksidanttien tunnettua pro-oksidatiivista käyttäytymistä suuremmilla määrillä. Metyleenisinisellä on samanlainen kaksijakoinen annosriippuvainen vaikutus: näissä soluviljelmissä se suojasi pieninä nanomolaarisina pitoisuuksina, mutta suurempina pitoisuuksina tai voimakkaassa valaistuksessa se voi tuottaa vetyperoksidia redox-kierron kautta. Tällaista pitoisuuteen liittyvää asiayhteyttä käsitellään artikkelissa reaktiiviset happiyhdisteet mitokondrioissa.

Eristetyillä mitokondrioilla tehdyissä kokeissa eroteltiin sitten ROS-lähteet. Kun läsnä oli kahdenarvoista rautaa, kompleksi I:lle elektroneja syöttävät substraatit yhdessä rotenonin kanssa lisäsivät koettimen hapettumista. Rotenoni estää elektroninsiirron flaviinikohdan jälkeen, joten sitä edeltävät välittäjät pysyvät pelkistyneinä ja elektroneja vuotaa hapelle matriksin puoleisesta flaviinista. Kompleksi III:lle elektroneja syöttävät substraatit yhdessä antimysiini A:n kanssa tuottivat runsaasti vetyperoksidia, mutta eivät käynnistäneet lipidiperoksidaatiota. Sama ROS-kokonaissignaali, eri sijainti, eri lopputulos. Sekä SkQ1 että metyleenisininen estivät kompleksi I:n käynnistämää peroksidaatiota estämättä itse vetyperoksidin tuotantoa. Tämä sijoittaa niiden vaikutuksen ROS:n muodostumisen jälkeiseen lipidiperoksidaatiovaiheeseen.

Rautaylikuormitusta tutkiva osuus ja lipofuskiinin antama vihje

Toinen tutkimus lähestyi kysymystä raudan näkökulmasta. Kun H9c2-sydänlihassolut altistettiin alle millimolaarisille ferriammoniumsitraattipitoisuuksille, niissä ilmeni ensin mitokondriaalista ROS-tuotantoa, sitten mitokondrioiden lipidiperoksidaatiota ja ferroptoosia sekä lopuksi lipofuskiinin kaltaisen pigmentin kertymistä 24 tunnin sisällä. Lipofuskiini on hapettuneista lipideistä ja proteiineista muodostuva autofluoresoiva, rautaa sisältävä jäännösaine, jota kertyy iän myötä. Sen nopea ilmaantuminen tässä yhdistää akuutin, raudan käynnistämän peroksidaation klassiseen ikääntymisen merkkiaineeseen. Sekä nanomolaarinen metyleenisininen että SkQ1 estivät peroksidaation, kuoleman ja pigmentin kertymisen. Eristetyt sydänmitokondriot vahvistivat saman kuvion: rotenoni yhdessä kahdenarvoisen raudan kanssa käynnisti peroksidaation ja pigmentin kaltaisen signaalin muodostumisen, ja molemmat aineet estivät tämän. Koko tapahtumaketju on raportoitu H9c2-sydänlihassolujen rautaylikuormitusta käsittelevässä tutkimuksessa. Pigmenttiä koskeva osa liittyy aiheeseen lipofuskiini ja solujen ikääntymisen merkkiaineet.

Mitä solujen selviytymistä mittaavat kokeet eivät osoita

CellTiterBluen kaltainen elinkelpoisuuden mittaus kertoo, kuinka moni maljan soluista pysyy metabolisesti aktiivisena laukaisijan ja mahdollisesti suojaavan aineen käsittelyn jälkeen. Se testaa mekanismia määritellyssä järjestelmässä. Se ei ole hoitotulos. Yhdessäkään näistä kokeista ei annettu ainetta potilaalle, mitattu sairauteen liittyvää päätetapahtumaa tai määritetty terapeuttista ikkunaa elimistössä.

Neljä rajoitusta on syytä todeta selvästi. Ensinnäkin solutyyppejä oli vain rajallinen joukko: transformoituja keuhkofibroblasteja, primaarisia ihofibroblasteja, joihin sisältyi yksi mitokondriaaliseen sairauteen liittyvä solulinja, rotan sydänlihassolulinja sekä eristettyjä rotan sydänmitokondrioita. Herkkyys vaihteli solulinjoittain, ja LHON-solulinja oli tutkimusasetelmassa tarkoituksellisesti poikkeuksellisen altis. Toiseksi laukaisijat edustavat laboratorio-olosuhteiden ääripäitä: täydellistä kuljetuksen tai synteesin estoa sekä rautakuormia, joita mikään kudos ei kohtaisi akuutisti. Kolmanneksi pitoisuutta ei voi muuntaa annokseksi kertolaskulla. Nanomolaarinen pitoisuus viljelyalustassa ei ole ihmisannos. Soluviljelmän ja ihmisen välillä vaikuttavat metyleenisinisen jakautuminen, sen pelkistyminen värittömään muotoon veressä ja kudoksissa, valoaltistus sekä kalvopotentiaali. Neljänneksi koettimet raportoivat vain omasta osastostaan. MitoCLoxin hapettuminen osoittaa, että mitokondrioissa muodostui lipidiradikaaleja. Se ei osoita, että solukalvon repeäminen, joka on todennäköinen lopullinen tapahtuma, estettiin suoraan eikä vältetty vaikuttamalla ketjun aiempiin vaiheisiin.

Rehellinen väite on siis tämä: näissä malleissa kompleksi I:stä peräisin olevat ROS-yhdisteet yhdessä raudan kanssa käynnistävät mitokondrioiden lipidiperoksidaation, joka edeltää ferroptoosia, ja metyleenisininen katkaisee tämän ketjun osan pieninä pitoisuuksina. Kaikki tämän osan ulkopuolelle ulottuvat päätelmät edellyttävät erilaisia kokeita ensin eläimillä ja sitten ihmisillä.