Metyleenisininen aivovaurioissa: prekliinisen näytön ymmärtäminen

Päähän kohdistuva isku, tukkeutunut valtimo ja hitaasti etenevä hermoston rappeumasairaus voivat kaikki johtaa samaan ongelmaan: aivoilla ei enää ole energiaa tehtäviensä hoitamiseen. Tämä yhteinen lopputulos selittää, miksi sama yhdiste nousee toistuvasti esiin kaikkien kolmen alan tutkimuskirjallisuudessa. Yhteinen lopputulos ei kuitenkaan tarkoita yhteistä tutkimusasetelmaa. Ennen vauriota annettu hoito, vauriota seuraavan tunnin aikana annettu hoito ja kuukausia myöhemmin arvioitu hoito testaavat eri ajatuksia, vaikka ruiskussa olisi samaa sinistä nestettä.

Tämä artikkeli käsittelee tutkimuskirjallisuuden vaurioihin keskittyvää osaa. Siinä tarkastellaan, mitä metyleenisinisen käyttö aivovaurioissa tarkoittaa eläinkokeissa, erotetaan traumaattinen vamma aivohalvauksesta ja kroonisesta hermoston rappeutumisesta sekä osoitetaan, miksi annoksen ajoitus selittää suurimman osan tutkimusten välisistä eroista.

Kolme vauriota, yksi energiantuotannon häiriö

Näitä malleja yhdistävä mekanismi sijaitsee mitokondrioissa. Normaalisti elektronit kulkevat elektroninsiirtoketjua pitkin ja tuottavat ATP:tä, ja hyvin toimiva ketju pitää reaktiiviset happiyhdisteet hallinnassa. Vaurion jälkeen ketjun osien toiminta heikkenee, ATP:n tuotanto vähenee ja vapaiden radikaalien tuotanto lisääntyy. Molecular Neurobiology -lehden vuoden 2018 katsaus kuvaa metyleenisinistä vaihtoehtoiseksi elektroninkuljettajaksi: se vastaanottaa elektroneja NADH:lta ja siirtää ne sytokromi c:lle, mikä lisää kompleksi IV:n aktiivisuutta ja palauttaa ATP-synteesin myös silloin, kun ketjun alkupään toiminta on heikentynyt.

Raportoidut luvut ovat konkreettisia. Solu- ja kudosleikevalmisteissa kompleksi IV:n aktiivisuus kasvoi 30–100 prosenttia, ja hapenkulutus kasvoi samassa suhteessa. Tämä viittaa siihen, että lisäelektronit tekivät hyödyllistä työtä sen sijaan, että ne olisivat vuotaneet ketjusta radikaaleina. Rotan aivohalvausmallissa ATP:n tuotanto vaurioituneella alueella oli 24 tuntia hoidon jälkeen noin 30 prosenttia suurempaa kuin hoitamattomilla eläimillä. Biochemistry (Moscow) -lehden vuoden 2022 katsaus täydentää kuvaa seurannaisvaikutuksilla: vähemmän oksidatiivista stressiä, hermoston tulehdusta ja apoptoosia sekä vaikutuksia monoamiinioksidaasiin, typpioksidisyntaasiin, mitokondrioiden uudismuodostukseen, autofagiaan ja väärin laskostuneiden proteiinien kasaantumiseen.

Perusajatus on siis yksinkertainen. Vaurio tukkii elektronien normaalin reitin, ja metyleenisininen tarjoaa kiertotien. Kaikki tämän jälkeen riippuu siitä, millaisesta vauriosta on kyse, milloin yhdiste annetaan ja miten vaikutuksia mitataan.

Traumaattinen vamma ei ole aivohalvaus

Traumaattisen aivovamman mallissa voima kohdistuu aivoihin kerralla. Ensisijainen vaurio on mekaaninen: kudos repeää, verisuonet rikkoutuvat ja veri-aivoeste avautuu minuuteissa. Metyleenisininen voisi uskottavasti vaikuttaa tätä seuraavaan toissijaiseen vaurioaaltoon, joka etenee tuntien ja päivien aikana, kun eloon jääneen kudoksen mitokondrioiden toiminta häiriintyy, tulehdus leviää ja turvotus lisääntyy. Näiden tutkimusten päätemuuttujat heijastavat tätä tapahtumaketjua: vaurion tilavuus, aivojen vesipitoisuus, hermosolujen eloonjääminen iskualueen lähellä sekä myöhempi käyttäytyminen, kuten motorinen toipuminen tai sokkelo-oppiminen.

Aivohalvauksen tai globaalin iskemian mallissa vaurion kulku on päinvastainen. Verenvirtaus pysähtyy, energiantuotanto häiriintyy minuuteissa ja virtauksen palautuminen aiheuttaa oman reperfuusiovaurionsa. Näissä malleissa annostelu ajoitetaan verisuonitapahtumaan, usein minuuttien sisään tukkeutumisesta tai reperfuusiosta. Päätemuuttujat kuvaavat kudoksen akuuttia kohtaloa tunneista päivään tai kahteen: infarktin kokoa, verenvirtausta ja varhaista toimintakyvyn palautumista. Aivohalvaustutkimuksissa käytetään myös esikäsittelyä, jossa eläimet saavat annoksen ennen verisuonen tukkeutumista. Se testaa ennaltaehkäisyä tavalla, jota ei voida eettisesti toteuttaa ihmisillä päävammoja koskevassa kokeessa.

Aivohalvaustulokset ovat vaurioita koskevan kirjallisuuden vahvimpia, ja niihin sisältyy myös selkein nollatulos. Rotilla, joille annettiin metyleenisinistä reperfuusion yhteydessä keskimmäisen aivovaltimon oltua tukossa yhden tunnin ajan, infarktit olivat päivänä 2 kooltaan 30 prosenttia pienempiä, ja suurempi osa uhanalaisesta ydinalueesta ja penumbrasta säilyi (Shen, 2013). Pysyvää tukosta käsitelleessä tutkimuksessa uhanalaisen kudoksen muuttuminen infarktiksi hidastui, mutta lopullinen infarktitilavuus 24 tunnin kohdalla ei pienentynyt kummallakaan tutkitulla annoksella (Rodriguez, 2014). Kolmannessa tukostutkimuksessa keskimmäinen annos pienensi infarktin koon noin puoleen, ja mitokondrioiden hienorakennetta sekä mitofagiaa tutkittiin suoraan iskeemisissä aivoissa. Samalla raportoitiin odotustenvastainen yksityiskohta: mitattu apoptoosi lisääntyi nekroosin vähentyessä (Di, 2015). Globaalissa iskemiassa jatkuva pieniannoksinen infuusio palautti sytokromi c -oksidaasin aktiivisuuden, ATP-tasot ja mitokondrioiden kalvopotentiaalin hippokampuksen haavoittuvalla CA1-alueella, säilytti alueen hermosoluja ja suojasi avaruudellista muistia (Lu, 2016). CA1-mittaus ansaitsee erityistä huomiota: siinä saatiin suoraa tietoa ATP:stä ja hengitysketjusta vaurioituneiden aivojen sisältä, kun taas traumaattisia aivovammoja koskevassa kirjallisuudessa nämä vaikutukset enimmäkseen päätellään mittaamisen sijaan.

Krooninen hermoston rappeutuminen eroaa molemmista. Alzheimerin, Parkinsonin ja Huntingtonin tautien malleissa eläimille annetaan yhdisteitä viikkojen tai kuukausien ajan ja mitataan proteiinien kasaantumista, dopamiinin käsittelyä tai asteittaista kognitiivista heikkenemistä. Näillä päätemuuttujilla ei ole juuri mitään yhteistä päiviä iskun jälkeen mitatun vaurion kanssa. Lukija, joka siirtää tuloksen yhdestä ryhmästä toiseen, vie havainnon sellaisen rajan yli, jota kokeet eivät koskaan ylittäneet. Hermoston rappeutumista koskevan tutkimuskirjallisuuden oppaamme pitää nämä pitkän aikavälin tutkimukset omassa viitekehyksessään, ja vertailu pelkästään aivohalvausta koskevaan näyttöön erottaa verisuonitukoksiin perustuvat koeasetelmat iskuihin perustuvista asetelmista yksityiskohtaisesti.

Mitä TBI-malleissa todella tehtiin

Metyleenisinisestä traumaattisen aivovamman hoidossa ei ole julkaistu yhtään ihmisillä tehtyä kliinistä tutkimusta. Koko TBI-tutkimusnäyttö perustuu eläinkokeisiin, pääasiassa rotilla ja hiirillä. Se keskittyy pieneen joukkoon kokeita, jotka kannattaa nimetä, sillä niiden yksityiskohdissa on eroja, jotka tiivistelmät häivyttävät.

Varhaisimmassa kontrolloitua aivokuoreen kohdistuvaa iskua käyttäneessä tutkimuksessa rotille annettiin laskimoon 1 mg/kg tunti lievän iskun jälkeen ja sen jälkeen 0.5 mg/kg kolmen tunnin kohdalla (Watts, 2014). MRI-kuvauksella mitattu vaurion tilavuus pysyi hoidetuilla eläimillä pienempänä kahden viikon seurannan ajan. Kävelytestin askelvirheet vähenivät merkitsevästi päivinä 1, 2 ja 7 mutta eivät päivänä 14. Päivänä 14 mikroskooppitutkimuksessa vaurioituneen aivokuoren rappeutuvia hermosoluja oli näkökenttää kohden 270 verrattuna 368:aan, ja poikkeavaa Nissl-värjäytymistä havaittiin 41 verrattuna 73:een. Toisin sanoen havaittiin varhaista suojaa, mutta käyttäytymisessä näkyvä etu hiipui toiseen viikkoon mennessä.

Diffuusin vamman koeasetelmassa hiirille aiheutettiin keskiviivaan kohdistuva nestepaineisku, ja niille annettiin yksi 2 mg/kg:n laskimonsisäinen annos puolen tunnin sisällä (Fenn, 2015). Hoidetuilla eläimillä tulehdukseen liittyvien geenien ilmentyminen oli vaimeampaa, tulehdusta ilmentäviä mikrogliasoluja oli vähemmän, turvotusta näytti olevan vähemmän eikä päivänä 7 havaittu masennuksen kaltaista käyttäytymistä. Nollatulokset ovat yhtä tärkeitä: itse vamma lisäsi aivojen vesipitoisuutta vain hieman, eikä metyleenisininen korjannut painonlaskua tai motorisen koordinaation puutetta. Tulehdusta hillitsevä vaikutus ei ole sama asia kuin täydellinen suoja.

Kahdessa hiiritutkimuksessa käytettiin samaa aikataulua: 1 mg/kg yhden tunnin kohdalla, 0.5 mg/kg kuuden tunnin kohdalla ja sen jälkeen päivittäinen annostelu kolmen päivän ajan. Ne laajensivat mekanismia koskevaa tietoa. Aivokuoreen kohdistuvan iskun mallissa hoito pienensi vaurion tilavuutta 24 tunnin ja 72 tunnin kohdalla sekä päivänä 14, säilytti hermosoluja ja lisäsi autofagian merkkiaineita (Zhao, 2016). Nestepaineiskumallissa se vähensi hermosolujen apoptoosia, tiivisti vuotavaa veri-aivoestettä ja paransi neurologisia pisteitä kahden viikon aikana (Shen, 2019). Zhaon tutkimuksessa aivojen vesipitoisuudessa ei kuitenkaan ollut eroa 72 tunnin kohdalla, eikä Shenin tutkimuksessa rotarod-testin suorituksessa ollut eroa päivinä 1 ja 3. Vauriota ja solujen eloonjäämistä kuvaavat päätemuuttujat paranivat, mutta turvotusta ja varhaista motoriikkaa kuvaavat päätemuuttujat eivät aina seuranneet mukana.

Ajoituksen kannalta erityinen on viivästetyn annostelun koe (Watts, 2016). Siinä käytettiin samaa iskumallia, mutta ensimmäinen annos annettiin vasta 24 tuntia vamman jälkeen. Päivään 2 mennessä viivästetyn hoidon ryhmässä havaittiin vaurion pienenemistä, joka oli verrattavissa ensimmäisten tuntien aikana hoidettuihin eläimiin, ja pieneneminen säilyi päivinä 7 ja 14. Käyttäytymiseen liittyvä signaali oli heikompi: askelvirheiden väheneminen viivästetyn hoidon ryhmässä oli tilastollisesti ei-merkitsevä suuntaus. Yksi laboratorio, yksi malli, yksi 24 tunnin aikaikkuna. Tämä on todellista näyttöä siitä, että aikaikkuna ulottuu ensimmäisiä tunteja pidemmälle, mutta samalla se on kaikki tätä väitettä tukeva näyttö. Huomaa muualla käytetyn sanan ”viivästetty” ansa: venäläisessä tutkimussarjassa, jonka otsikot käsittelivät viivästettyä hermoston suojaa, annos annettiin 30 minuutin kohdalla. Viivästetyllä tarkoitettiin siinä pitkäkestoisia tuloksia, ei hoidon myöhäistä aloittamista.

Pienempi paikallista vammaa koskenut rottatutkimus täydentää ajoituskuvaa toisesta suunnasta: sekä välittömästi ennen vammaa että 30 minuuttia sen jälkeen annettu annos vähensi raajojen toimintahäiriötä (Stelmashook, 2019). Esikäsittely toimii laboratoriossa juuri siksi, että laboratorio määrää vamman ajankohdan.

Annoksia on tässä tarkasteltava täsmällisesti. Katsausten mukaan pienet annokset stimuloivat mitokondrioiden hengitystä ja suuret annokset estävät sitä. Sama kaksivaiheinen vaste näkyy laajemminkin metyleenisinisen farmakologiassa. Siksi tuloksia ei voi tulkita niin, että enemmän sinistä tarkoittaisi parempaa toipumista. Kukin tutkimus testaa yhtä käyrän pistettä. Annosvastetta käsittelevä artikkeli seuraa tätä käyrää eri malleissa, ja turvallisuus- ja haittavaikutusprofiili käsittelee sitä, mitä suuremmat annokset sen sijaan tekevät.

Lue taulukkoa riveittäin: sama yhdiste, kolme erilaista aikajanaa. Ennaltaehkäisy kuuluu keskimmäiselle riville, välitön hoito kahdelle ensimmäiselle ja myöhemmin arvioidut tulokset ensimmäiselle ja kolmannelle.

Ennaltaehkäisy, välitön hoito, myöhemmin arvioidut tulokset

Ennaltaehkäisy on helpoimmin väärin ymmärrettävä väite. Iskemiamalleissa ennen verisuonen tukkeutumista annoksen saaneet eläimet pärjäävät paremmin. Tätä tulosta siteerataan joskus ikään kuin metyleenisininen suojaisi kaikkia aivoja miltä tahansa tulevalta vauriolta. Se ei osoita mitään tällaista. Se osoittaa, että vaihtoehtoisella elektronireitillä valmistellut mitokondriot sietävät paremmin ennalta ajoitettua verenvirtauksen menetystä. Kukaan ei aikatauluta päävammaa.

TBI-näyttö keskittyy välittömään hoitoon. Iskun jälkeisinä tunteina annettu annos kohdistuu toissijaiseen vaurioketjuun sen ollessa vielä käynnissä: energiantuotannon häiriöön, oksidatiiviseen stressiin, tulehdukseen ja turvotukseen. Tässä paranevat vauriota ja turvotusta kuvaavat päätemuuttujat ovat todellisia hoitovaikutuksia, mutta kyse on prosessin hoitamisesta, ei repeytyneen kudoksen palauttamisesta ennalleen.

Myöhemmin arvioidut tulokset ovat kolmas käsite. Viikkoja vamman jälkeen mitattu käyttäytyminen tai kuukausia rappeumamallin aloittamisen jälkeen mitattu proteiinien käsittely kertoo, säilyikö varhainen suoja tai muuttivatko hitaat prosessit suuntaansa. Pienempi vaurio 24 tunnin kohdalla, tilastollisesti ei-merkitsevä käyttäytymissuuntaus 24 tunnilla viivästetyn annoksen jälkeen ja sokkelosuorituksen paraneminen kuukausia jatkuneen annostelun aikana ovat kolme eri väitettä, joilla on kolme eri todistustaakkaa. Tällä hetkellä vain ensimmäinen ylittää näyttökynnyksensä useammin kuin kerran.

Mitä tämä näyttö ei voi osoittaa

Kaikilla edellä kuvatuilla tuloksilla on sama raja. Jyrsijöiden mitokondriot reagoivat metyleenisiniseen tavoilla, jotka saattavat päteä myös ihmisen mitokondrioihin. Rotta, joka saa laskimonsisäisen annoksen minuutteja tarkasti säädetyn iskun jälkeen, ei kuitenkaan ole sama kuin ihminen, joka saapuu päivystykseen tuntikausia kaatumisen jälkeen. Anestesia, hallittu vamman vaikeusaste, nuoret ja terveet eläimet sekä lyhyt seuranta rajoittavat kaikki tulosten siirrettävyyttä. Metyleenisinisestä ei ole yhtään räjähdysvammaa koskevaa tutkimusta, joten sotilastaustaisille lukijoille olennaisimmasta vammatyypistä on vähiten näyttöä.

Myöskään annosten soveltamisesta ihmisille ei ole tarjolla tietoa. Eläintutkimuksissa käytetään laskimonsisäistä ja vatsaontelonsisäistä annostelua, ja annokset on valittu kokeellista hallintaa varten. Kyse ei ole vähittäismyynnissä olevista suun kautta otettavista tipoista. Mikään näissä tutkimuksissa ei määritä ihmiselle annosteluohjelmaa, eikä niissä testata metyleenisinistä päävamman tavanomaisen hoidon rinnalla.

Rehellinen yhteenveto mahtuu siis yhteen kappaleeseen. Jyrsijöillä traumaattisen tai iskeemisen aivovaurion aikoihin annettu metyleenisininen säilyttää mitokondrioiden energiantuotantoa, ja tätä seuraavat pienemmät vauriot ja paremmat toipumispisteet. Yhdessä iskututkimuksessa osa vauriota pienentävästä vaikutuksesta säilyi, vaikka ensimmäinen annos annettiin 24 tunnin viiveellä. Sitä, tapahtuuko mitään tästä vaurioituneissa ihmisaivoissa, ei ole testattu, ja TBI- sekä aivohalvaustutkimuksissa testataan eri ajoituksia suhteessa eri päätemuuttujiin. Jokainen, joka myy varmuutta tämän näytön pohjalta, lisää mukaan ainesosan, jota kokeissa ei koskaan ollut.