چه کسی رنگ‌آمیزی بنفش خون را ابداع کرد؟ متیلن بلو، مالاخوفسکی، رومانوسکی و گیمسا

ائوزین قرمز است. متیلن بلو آبی است. این دو را مخلوط کنید، مخلوط را روی گسترش خشک‌شدهٔ خون بزنید، و بخش‌هایی از گسترش بنفش می‌شوند.

نه همهٔ بخش‌ها. در یک نمونهٔ خوب، هسته‌های گلبول‌های سفید رنگ قرمزـبنفش می‌گیرند و کروماتین درون انگل مالاریا نیز همین رنگ را می‌گیرد، درحالی‌که گلبول‌های قرمز اطراف صورتی می‌مانند و سیتوپلاسم خاکستریـآبی باقی می‌ماند. همین بنفش است که انواع سلول را از یکدیگر متمایز می‌کند.

هیچ‌یک از دو بطری حاوی رنگ بنفش نیست. این رنگ تنها هنگامی پدید می‌آید که یک محصول تجزیهٔ مشخصِ متیلن بلو، روی لام با ائوزین تماس پیدا کند؛ و در دهه‌های 1880 و 1890 هیچ‌کس از وجود آن محصول خبر نداشت، چه رسد به اینکه بداند چیست. کسانی که در پی این رنگ بودند، به‌تنهایی با رنگ‌های ناخالص کار می‌کردند و هیچ راه قابل‌اعتمادی نداشتند تا بفهمند در بطری‌ای که دو ماه روی قفسه مانده بود چه چیزی وجود دارد.

به همین دلیل، پرسش عنوان بیش از یک پاسخ قابل‌دفاع دارد و به همین دلیل، پاسخ در 2011 تغییر کرد.

نتیجه‌ای که با مخلوط تغییر می‌کرد

این رنگ‌آمیزی یک‌باره اختراع نشد؛ به‌تدریج شکل گرفت. هر تغییر در مخلوط دقیقاً یک دادهٔ قابل‌مشاهدهٔ تازه فراهم می‌کرد، و توالی این داده‌ها روشن‌ترین راه برای خواندن این تاریخ است.

الگوی ستون آخر مهم است. هر پیشرفت دامنهٔ رنگ‌ها را گسترش داد و هر گسترش، ساختار دیگری را آشکار کرد. بنفش صرفاً آرایه‌ای در این روش نیست؛ تفاوت میان دیدنِ حضور یک انگل و دیدنِ اجزای تشکیل‌دهندهٔ آن است. اینکه خود رنگ چگونه از کارخانهٔ رنگ‌سازی BASF به پزشکی راه یافت، تاریخی طولانی‌تر با اسناد مستقل است. توالی کامل بالا، همراه با منبع هر مدخل، در قالب خط زمانی مشارکت‌کنندگان با پیوند به منابع نگهداری می‌شود.

شکل: همان شش مخلوط، با نمایش آنچه در ظرف بود و آنچه از آن حاصل شد. دایره‌ها رنگ‌های موجود را نشان می‌دهند؛ بلوک‌های زیر آن‌ها رنگ‌هایی را نشان می‌دهند که این مواد می‌توانستند در گسترش خون ایجاد کنند. هیچ مخلوطی پیش از 1890 بلوک قرمزـبنفش ندارد، و هیچ مخلوطی پس از آن بدون این بلوک نیست.

مردی که عمداً از بوراکس استفاده کرد

ارنست مالاخوفسکی پزشکی در برسلاو، وروتسواف امروزی، بود که دوران کاری‌اش را در مطب خصوصی و درمانگاه کوچکی که با یک همکار اداره می‌کرد گذراند و کار آزمایشگاهی را در اوقات فراغتش انجام می‌داد. او در 12 مارس 1857 در استرزلنو به دنیا آمد، در دانشگاه برسلاو پزشکی خواند و از 1882 تا 1887 به‌عنوان دستیار طب داخلی در بیمارستان آل‌سینتس کار کرد؛ بیمارستانی که آن زمان دومین بیمارستان بزرگ آلمان بود.

او در 1888 با رنگ‌آمیزی دوگانهٔ خنچینسکی و پلن آغاز کرد. در نمونه‌ای که در 1889 آماده کرده بود، دید کروماتین هستهٔ پلاسمودیوم رنگی متفاوت از سیتوپلاسم می‌گیرد، اما بعد نتوانست آن را تکرار کند. اسیدی‌کردن متیلن بلو را امتحان کرد که نتیجه را بدتر کرد. قلیایی‌کردن آن با بوراکس را آزمود که هر بار جواب داد. او روش را در 15 ژوئن 1890 به‌صورت عمومی نمایش داد و در اوت 1891 شرح کامل‌تری، از جمله دستور استفاده از بوراکس، منتشر کرد. او یادآور شد که رنگ‌آمیزی بیست‌وچهار ساعت طول می‌کشد و نتایج به‌آسانی تکرارپذیرند.

بیست‌وچهار ساعت در یک آزمایشگاه تشخیصی زمان زیادی است، و مقالهٔ او نیز چندان بر رنگ بنفشـقرمز هستهٔ انگل تأکید نکرد. دلیل هرچه بود، هیچ‌کس قلیایی‌کردن عمدی متیلن بلو را دنبال نکرد تا اینکه نوخت در 1898 دوباره آن را انجام داد. مالاخوفسکی دیگر هرگز دربارهٔ رنگ‌آمیزی خون ننوشت.

اینکه تا همین اواخر اطلاعات بسیار کمی دربارهٔ او وجود داشت، بیشتر به وضعیت اسناد بایگانی مربوط است تا به یک راز. تقریباً هیچ نشانی از زندگی او در نوشته‌های پزشکی باقی نماند و آنچه باقی ماند از یک مسیر به دست رسید. دخترش ماری در 1939 آلمان را به مقصد لندن ترک کرد، در ارتش بریتانیا خدمت کرد و در کانادا ساکن شد؛ مجموعهٔ اسناد خانوادگی او سرانجام به مؤسسهٔ لئو بک در نیویورک رسید. برادرش لئو در جنگ جهانی اول کشته شد. خواهرش اوا در آوریل 1942 از برسلاو به اردوگاه ترانزیت ایزبیتسا تبعید شد و هرگز بازنگشت. مادرش هدویگ در 22 آوریل 1942، به‌جای انتظار برای همان تبعید، به زندگی خود پایان داد. مالاخوفسکی پیش از همهٔ این رویدادها، در 1934، درگذشته بود.

تاریخ خانوادگی‌ای که چنین پایان می‌یابد، دیگر در منابع هم نقل نمی‌شود. دو مقاله‌ای که مالاخوفسکی را دوباره وارد تاریخ تکامل این رنگ‌آمیزی کردند، هر دو در 2011 منتشر شدند و بر پایهٔ اسناد بایگانی در پوزنان و وروتسواف و اسناد ماری در نیویورک تدوین شدند.

یک بطری کپک‌زده و یک روس خوش‌شانس

دیمیتری رومانوسکی در آکادمی پزشکی نظامی سن‌پترزبورگ پزشکی خواند و بیشتر دوران کاری‌اش را به پژوهش دربارهٔ مالاریا اختصاص داد. در 1890 روشی منتشر کرد که روی کاغذ تقریباً با روش خنچینسکی یکسان بود: متیلن بلوی دست‌نخورده و ائوزین، با مقدار کمی ائوزین بیشتر.

در سپتامبر 1891 روشی را منتشر کرد که نامش را بر سر زبان‌ها انداخت، و جزئیات تعیین‌کننده در میان دستورالعمل‌ها پنهان بود. بهترین نتایج او از محلول ذخیرهٔ متیلن بلو به دست می‌آمد؛ محلولی که بیش از دو ماه مانده بود و روی آن کپک رشد می‌کرد. کپک و زمان ماندن، رنگ را تا حدی دمتیله کرده بودند. رومانوسکی این را نمی‌دانست و نمی‌توانست آن را کنترل کند، و دیگر پژوهشگرانی که روش او را آزمودند نتوانستند رنگ بنفش را به دست آورند. رسالهٔ او در ژوئن 1891 در سن‌پترزبورگ تحویل داده شده بود؛ به همین دلیل روایت رایج، 1891 را سال کشف می‌داند.

نمایش مالاخوفسکی در ژوئن 1890، بیش از یک سال زودتر، انجام شده بود و روش او عمداً این نتیجه را ایجاد می‌کرد.

چرا این رنگ‌آمیزی به نام فرد نادرستی نام‌گذاری شد

استدلال به نفع مالاخوفسکی را کریستین کرافتس، ارنست همپلمان و باربارا اولکسین تدوین کردند، و این استدلال بر چهار نکته تکیه دارد. تاریخ نمایش عمومی: ژوئن 1890 در برابر سپتامبر 1891. واژهٔ عمدی در برابر واژهٔ تصادفی. این واقعیت که مالاخوفسکی روش خود را با تمام جزئیات، از جمله بوراکس، منتشر کرد، درحالی‌که روش رومانوسکی به متغیری کنترل‌نشده وابسته بود. و این مشاهده که توصیف هستهٔ پلاسمودیوم، همراه با بنفشی که آن را آشکار می‌کرد، عملاً هفت سال از نوشته‌های علمی ناپدید شد، زیرا هیچ‌کس نمی‌توانست نسخهٔ تصادفی را تکرار کند.

آن‌ها نتیجه‌گیری خود را بی‌پرده بیان می‌کنند. در مقالهٔ زندگی‌نامه‌ای، این انتساب را «تحریفی فاحش» می‌نامند و از رالف لیلی نقل می‌کنند که در 1978 نوشت: «شاید باید این خانواده از رنگ‌آمیزی‌ها را رنگ‌آمیزی‌های مالاخوفسکی بنامیم.»

این ادعا، مانند بیشتر ادعاهای تقدم، محل اختلاف است، و بهتر است به‌جای حل‌وفصل اختلاف، شکل آن را توضیح دهیم. بحث دربارهٔ تقدم باید مشخص کند که کشف چه بوده است. اگر کشف همان رنگ بنفش باشد، مالاخوفسکی نمایش مستندِ زودتری دارد. اگر کشف، روش منتشرشده باشد، هر دو مرد در 1891 مقاله منتشر کردند و نام‌گذاری به نام رومانوسکی انجام شد. اگر کشف، توضیح پدیده باشد، هیچ‌کدام ادعایی ندارند، زیرا هیچ‌یک نمی‌دانستند رسیدنِ رنگ همان دمتیلاسیون است و هیچ‌یک نمی‌توانستند بگویند اساساً چرا این رنگ ظاهر می‌شود. همین نکتهٔ آخر است که روایت‌های عمومی از آن می‌گذرند. جزء فعال ناخالصی‌ای بود که هیچ‌کس شناسایی نکرده بود، و نخستین کسی که عمداً این رنگ را تولید کرد، آن را با دستورالعملی تجربی و تکرارپذیر به دست آورد، نه با درک اینکه آن دستورالعمل چه می‌کند.

دو مقالهٔ 2011 کامل‌ترین بیان منتشرشدهٔ استدلال به نفع مالاخوفسکی هستند و هر دو در PubMed رایگان قابل‌مطالعه‌اند: مرور مفصل در PMID 21235291 و مقالهٔ زندگی‌نامه‌ای در PMID 21660627. رکورد PubMed برای مقالهٔ مروری، نقدی بر آن را نیز فهرست می‌کند که در همان مجله، در ادامهٔ همان سال، در 86(5):366 منتشر شد؛ یادآوری به‌جایی که این استدلال از همان آغاز انتشار با مخالفت مکتوب روبه‌رو بود.

این اختلاف، اختلافی دربارهٔ شیمی نیست. همهٔ طرف‌ها توافق دارند که بنفش چیست و کدام اجزا آن را تولید می‌کنند. اختلاف بر سر این است که چه کسی زودتر به آن رسید، و اینکه آیا اتفاقی که هیچ‌کس نتوانست تکرارش کند، اصلاً رسیدن به نتیجه محسوب می‌شود یا نه.

نام‌های بعدی چه دستاوردی داشتند

اگر مالاخوفسکی نخستین کسی بود که بنفش را تولید کرد، چرا این رنگ‌آمیزی نام‌های رومانوسکی، رایت و گیمسا را بر خود دارد؟

چون رنگ‌آمیزی‌ای که یک‌بار در دست ابداع‌کننده‌اش جواب می‌دهد، هنوز یک معرف قابل‌استفاده نیست. کارهای بعدی، مخلوطی بدقلق را به چیزی تبدیل کردند که یک تکنسین در کشوری دیگر هم بتواند در یک سه‌شنبه از آن استفاده کند.

نوخت با استدلال به نتیجه رسید. پس از آنکه نتوانست با یک رنگ خنثی ساده نتیجه‌ای قابل‌اعتماد بگیرد، به این نتیجه رسید که بنفش باید از چیزی در متیلن بلو ناشی شود که خودِ متیلن بلو نیست، و به جست‌وجوی آن پرداخت. اونا پیش‌تر متوجه شده بود که محلول‌های کهنهٔ متیلن بلو، گرانول‌های ماست‌سل را قرمز می‌کنند و پیشنهاد کرده بود که با رسیدن رنگ، ماده‌ای تازه تشکیل می‌شود. برنتسن در 1885 نشان داده بود که شرایط قلیایی گروه‌های متیل را از متیلن بلو جدا می‌کند و این محصولات همان‌هایی هستند که امروز آزورها می‌نامیم. نوخت جزء فعال را با کلروفرم استخراج کرد و تنها می‌توانست آن را قرمز حاصل از متیلن بلو بنامد؛ میکائلیس در 1901 آن را آزور I نامید. جنر مشکل آماده‌سازی و استفاده را حل کرد. حل‌کردن دوبارهٔ رسوب متیلن بلو و ائوزین در متانول مطلق، یک محلول پایدار واحد به دست داد که هم‌زمان با رنگ‌آمیزی، گسترش را تثبیت می‌کرد و نیاز به تثبیت حرارتی را از میان برد. لیشمن و رویتر رنگ پلی‌کروم‌شده را با یک حلال الکلی ترکیب کردند و هم پایداری و هم بنفش را به دست آوردند. رایت انکوباسیون دوازده‌ساعته در 65 °C و ده روز ماندن را با یک ساعت قرارگرفتن در جریان بخار جایگزین کرد. گیمسا به‌کلی اتکا به محلولی را که به‌طور تصادفی رسیده بود کنار گذاشت و از مقادیر اندازه‌گیری‌شدهٔ رنگ‌های شناخته‌شده همراه با گلیسرول در متانول استفاده کرد تا محصول در گرمای مناطق گرمسیری دوام بیاورد. او هرگز منتشر نکرد که متیلن آزور خالص را چگونه می‌سازد. آن را به آزمایشگاه دکتر گروبلر در لایپزیگ فروخت؛ آزمایشگاهی که آن را با نام آزور I عرضه کرد و مدعی شد تنها نسخهٔ خودش رنگ گیمسای اصیل است.

هویت آن آزور هنوز محل بحث است. برخی معتقدند صرفاً متیلن بلوی پلی‌کروم‌شده بود و برخی دیگر آن را غنی از Azure B می‌دانند. پاسخ از دل یک جنگ بیرون آمد. هنگامی که رنگ‌های آلمانی دیگر در دسترس نبودند، تیمی از سازمان خدمات بهداشت عمومی ایالات متحده، شامل رالف لیلی، موریس رو و ایمی ویلکاکس، دریافت که بهترین رنگ‌آمیزی از سه جزء جداشده حاصل می‌شود: متیلن بلوی تغییرنیافته، محصول تجزیهٔ دمتیله‌شدهٔ آن یعنی Azure B، و ائوزین. Azure B جای آزور I ناموجود را گرفت، و این سه جزء هنوز پایهٔ رنگ‌آمیزی‌ای هستند که امروزه برای تشخیص مالاریا استفاده می‌شود.

شیمیِ برهم‌کنش این سه جزء روی لام، پرسشی جداگانه و موضوع صفحه‌ای دیگر است. صفحهٔ نقش رنگ‌ها و شیمی رنگ‌آمیزی‌های نوع رومانوسکی توضیح می‌دهد که Azure B و ائوزین هرکدام چه می‌کنند و چرا این دو در کنار هم رنگی می‌سازند که هیچ‌یک به‌تنهایی تولید نمی‌کند. صفحهٔ میکروسکوپی و کاربردهای آزمایشگاهی به جنبهٔ عملی می‌پردازد: یک نمونهٔ آماده‌شده چه چیزی را نشان می‌دهد و چگونه می‌توان تشخیص داد که محصولی مشخص برای روشی که قصد استفاده از آن را دارید مناسب است یا نه.

بخشی از تاریخ که هنوز موضوعیت دارد

یک جزئیات این داستان در 1902 پایان نیافت. حدود پنجاه سال، مهم‌ترین جزء رنگ‌آمیزی استاندارد مالاریا در جهان، ناخالصی‌ای بی‌نام بود. حضورش تصادفی بود، مقدارش از بطری‌ای به بطری دیگر تفاوت داشت، هویتش بخشی از آن مدت یک راز تجاری بود و نسبتش تا دههٔ 1940 محل بحث باقی ماند. کسانی که از این رنگ‌آمیزی استفاده می‌کردند بی‌دقت نبودند. راهی نداشتند که بدانند در بطری چه چیزی هست.

نسخهٔ امروزی همین مشکل، مشخصاتی است که تنها بخشی از ماده را توصیف می‌کند. انطباق با USP راه دستیابی به بالاترین خلوصی است که بازار عرضه می‌کند، زیرا یک استاندارد کامل و منتشرشده است، نه یک اندازه‌گیری منفرد: هویت، خلوص، ناخالصی‌های آلی از جمله رنگ‌های آزور، حلال‌های باقی‌مانده، ناخالصی‌های عنصری، باقی‌مانده پس از سوزاندن، حدود میکروبی و اندوتوکسین‌های باکتریایی. Blupreme متیلن بلوی خود را از یک تولیدکنندهٔ دارویی تهیه می‌کند و گواهی کامل آنالیز را منتشر می‌کند تا تک‌تک موارد این فهرست قابل‌بررسی باشند، نه صرفاً ادعا. گواهی‌ای که نتیجهٔ آزمون فلزات سنگین را گزارش می‌کند و آن را انطباق با USP می‌نامد، معادل امروزی بطری‌ای با برچسب «متیلن بلوی رسیده» است: شاید معرف خوبی باشد، اما برچسب نمی‌گوید چه چیزی درون آن است.