مقاله
متیلن بلو برای رنگ‌آمیزی DNA و RNA: کاربردها در ژل و غشا
دانشجویی الکتروفورز ژل آگارز را انجام می‌دهد، آن را با متیلن بلو رنگ‌آمیزی می‌کند و در جایی که انتظار نواری پررنگ داشت، چیزی نمی‌بیند. در بخش کناری، پژوهشگر پسادکتری با همان بطری آبی، غشای نورترن را رنگ‌آمیزی می‌کند و در سه دقیقه نوارهای ریبوزومی واضحی به دست می‌آورد. دانشجو نتیجه می‌گیرد که آزمایش ژل شکست خورده است. اما ژل مشکلی نداشته است. این دو کار متفاوت بودند و همان رنگ، با حساسیت متفاوت، پس‌زمینه متفاوت و قواعد متفاوت برای مراحل بعدی، به آن‌ها پاسخ می‌دهد.
رنگ‌آمیزی DNA و RNA با متیلن بلو از نظر شیمی مشترک‌اند، اما هدف یکسانی ندارند. در ژل، رنگ نشان می‌دهد چه مقدار اسید نوکلئیک درون یک ماتریس متخلخل قرار دارد. روی غشا، نشان می‌دهد آیا انتقال موفق بوده و آیا بارگذاری در مسیرها یکنواخت انجام شده است. وقتی این تفاوت روشن شود، پروتکل‌ها، حدهای آشکارسازی و محدودیت‌های سازگاری هم معنا پیدا می‌کنند.
پاسخ کوتاه
متیلن بلو یک رنگ کاتیونی مسطح است که به‌صورت غیرکووالانسی و برگشت‌پذیر به اسیدهای نوکلئیک متصل می‌شود؛ این اتصال ترکیبی از جاذبه الکترواستاتیکی به فسفات، میان‌نشینی بین جفت‌بازها و اتصال به شیار کوچک است. نکته اصلی همین برگشت‌پذیری است. می‌توان نوارها را رنگ‌آمیزی کرد، با نور مرئی مشاهده و ثبت کرد، سپس برای کلون‌سازی، هیبریداسیون یا پروب‌گذاری مجدد، رنگ را زدود یا نمونه را پاک‌سازی کرد.
برای رنگ‌آمیزی DNA دورشته‌ای در ژل آگارز با متیلن بلو، دستور سریع استاندارد شامل محلول 0.02 درصد w/v معادل 200 میکروگرم در mL در آب، حدود 15 دقیقه رنگ‌آمیزی و حدود 15 دقیقه رنگ‌زدایی با آب، و مشاهده روی جعبه نور سفید است. برای غشاها، دستور کلاسیک بلات نورترن شامل 0.02 تا 0.04 درصد رنگ در سدیم استات با pH نزدیک به 5.2، چند دقیقه رنگ‌آمیزی پس از انتقال و تثبیت، سپس آبکشی و رنگ‌زدایی کامل پیش از هیبریداسیون است. حساسیت محدود است: در شرایط مناسب، ده‌ها تا صدها نانوگرم در هر نوار ژل؛ راهنماهای محافظه‌کارانه مقدار 0.5 تا 1 میکروگرم را ذکر می‌کنند. این مقدار چند مرتبه بزرگی بالاتر از حد آشکارسازی اتیدیوم بروماید و رنگ‌های SYBR است. روی غشاها، حد آشکارسازی واحد و کاربردی برای یک رونوشت مشخص وجود ندارد، زیرا رنگ عمدتاً RNA ریبوزومی فراوان و کل ماده بارگذاری‌شده را نشان می‌دهد. در هیچ‌یک از این دستورها، محلول مکمل عرضه‌شده در بازار را جایگزین نکنید. روش‌های اعتبارسنجی‌شده بر استفاده از رنگ با گرید تجزیه‌ای، بافرهای مشخص و، هنگام کار با RNA، شرایط عاری از RNase تکیه دارند.
اتصال چگونه رخ می‌دهد و کجا گمراه‌کننده است
مدل کاربردی سه بخش دارد. نخست، سامانه حلقوی با بار مثبت به اسکلت فسفاتی با بار منفی جذب می‌شود. بررسی‌های طیف‌سنجی نشان می‌دهند که در غلظت پایین نمک، این مؤلفه الکترواستاتیکی غالب است؛ در عین حال، مدل‌سازی و دینامیک مولکولی، میان‌نشینی و اتصال به شیار کوچک را حالت‌های پایدار اتصال به DNA دورشته‌ای می‌دانند، چنان‌که در یک مطالعه طیف‌سنجی درباره اتصال متیلن بلو به DNA جمع‌بندی شده است. دوم، تا حدی ترجیح برای GC وجود دارد؛ مدل‌سازی گام‌های CpG و GpC را ترجیح می‌دهد و آزمایش‌ها در پژوهش مربوط به ترجیحات میان‌نشینی متیلن بلو، اتصال ترجیحی به ساختارهای دورشته‌ای غنی از GC را گزارش می‌کنند، اما ساختارهای دورشته‌ای AT نیز رنگ را متصل می‌کنند. رنگ‌آمیزی معمول، اختصاصیِ توالی نیست. سوم، DNA تک‌رشته‌ای و RNA عمدتاً از طریق برهم‌کنش‌های الکترواستاتیکی و برهم‌کنش‌های انباشتی با بازهای در دسترس و نواحی دورشته‌ای به رنگ متصل می‌شوند؛ به همین دلیل شدت رنگ‌آمیزی با طول، توالی و ساختار ثانویه تغییر می‌کند.
دو پیامد از این موضوع ناشی می‌شود. چون اتصال غیرکووالانسی است، رنگ با شست‌وشو خارج می‌شود. نوارهای پلی‌آکریل‌آمید به‌سرعت کم‌رنگ می‌شوند، مگر آنکه عمداً تثبیت شوند؛ وجود نسخه‌ای ویژه برای تثبیت دائمی دقیقاً به این دلیل است که رنگ‌آمیزی معمول موقتی است، همان‌طور که سوتو و درِیپر برای ژل‌های PAGE توضیح داده‌اند. چون این رنگ حساس‌کننده نوری است، تابش طولانی نور شدید به DNA رنگ‌آمیزی‌شده در حضور اکسیژن می‌تواند گوانین را اکسید کند و در نهایت شکاف‌های تک‌رشته‌ای ایجاد کند؛ این سازوکار در پژوهش مربوط به اکسیداسیون گوانین با حساس‌سازی متیلن بلو شرح داده شده است. مشاهده کوتاه با نور سفید از آسیب شناخته‌شده UV در روش‌های کلاسیک اتیدیوم بروماید جلوگیری می‌کند و این مزیت برای بازیابی آماده‌سازی نمونه واقعی است. نور مرئی ملایم‌تر است، نه بی‌ضرر. اگر قرار است DNA کلون‌سازی شود، زمان نوردهی را کوتاه نگه دارید. برای آشنایی با شیمی نوری گسترده‌تر پشت این احتیاط، دو مسیر در شیمی نوری متیلن بلو را ببینید. برای آشنایی با زوج اکسایش‌ـ‌کاهش و حالت‌های بار که توضیح می‌دهند چرا شکل اکسیدشده متصل می‌شود و شکل کاهش‌یافته متصل نمی‌شود، به شیمی ساختار و خواص متیلن بلو مراجعه کنید.
کار اول: رنگ‌آمیزی درون ژل‌ها
رنگ‌آمیزی ژل به یک پرسش پاسخ می‌دهد: آیا در این نوار، اسید نوکلئیک کافی برای مشاهده با چشم وجود دارد؟ DNA دورشته‌ای در آگارز، موردی است که بهتر از همه بررسی شده است. روش اولیه رنگ‌آمیزی ژل با متیلن بلو توسط فلورس و همکاران، پروتکل سریع 0.02 درصد را روی آگارز 1 درصد اعتبارسنجی کرد و بازیابی و کلون‌سازی موفق پس از آن را نشان داد. همین پروتکل تأمین‌کننده در صفحه محصول متیلن بلو IBI Scientific آمده است؛ در آن، دستور 0.04 درصد برای غشا و نسخه سریع برای ژل در کنار هم درج شده‌اند.
روند عملی کار:
- الکتروفورز ژل را طبق روال معمول انجام دهید. رنگ‌آمیزی را پس از الکتروفورز انجام دهید، نه در حین آن، مگر اینکه انتقال یا قدرت تفکیک برای روش اصلاح‌شده اعتبارسنجی شده باشد.
- ژل را با تکان‌دادن ملایم، حدود 15 دقیقه در محلول 0.02 درصد w/v متیلن بلو در آب مقطر غوطه‌ور کنید.
- با چند نوبت تعویض آب، در مجموع حدود 15 دقیقه رنگ‌زدایی کنید تا پس‌زمینه ماتریس کاهش یابد و نوارها مشخص شوند.
- بلافاصله روی دستگاه نوردهی سفید عکس بگیرید.
آگارز و پلی‌آکریل‌آمید رفتار متفاوتی دارند. آگارز رنگ را در ماتریس نگه می‌دارد، بنابراین رنگ‌زدایی مرحله کند کار است. ژل‌های نازک پلی‌آکریل‌آمید سریع رنگ می‌گیرند، اما سریع هم رنگ را از دست می‌دهند؛ این ویژگی برای برش و جداسازی نمونه مفید است، ولی برای ثبت بایگانی نامناسب است. الیگونوکلئوتیدهای سنتزی در پلی‌آکریل‌آمید را می‌توان با همان دستور 0.02 درصد، در 20 تا 30 دقیقه و با شست‌وشوهای مکرر با آب شناسایی کرد؛ این کار از روش‌های جاافتاده PAGE به شیوه Current Protocols پیروی می‌کند. نسخه‌های بسیار رقیق، نزدیک به 0.0002 درصد در TBE رقیق، برای آماده‌سازی الیگونوکلئوتیدها طی چند ساعت گزارش شده‌اند، اما پشتوانه شواهد آن‌ها ضعیف‌تر است.
تفاوت DNA و RNA مهم است. DNA دورشته‌ای قوی‌ترین اتصال ساختاری را ایجاد می‌کند. RNA و DNA تک‌رشته‌ای رنگ می‌گیرند، اما ضعیف‌تر و با پیش‌بینی‌پذیری کمتر. برای ژل‌های آگارز فرمالدهیدِ RNA، بیشتر آزمایشگاه‌ها از رنگ‌آمیزی آبی درون ژل صرف‌نظر می‌کنند و ابتدا RNA را به غشا انتقال می‌دهند، سپس آنجا رنگ‌آمیزی می‌کنند. با این کار، سیگنال ضعیف ژل با سیگنال واضح‌تر غشا و یک سابقه ثبت‌شده از بارگذاری جایگزین می‌شود.
کار دوم: رنگ‌آمیزی روی غشاها
رنگ‌آمیزی غشا به پرسش متفاوتی پاسخ می‌دهد: آیا انتقال موفق بوده و آیا مسیرها قابل مقایسه‌اند؟ کاربرد کلاسیک آن، رنگ‌آمیزی برگشت‌پذیر بلات نورترن به روش هرین و اشمیت است؛ دستور اولیه شامل 0.04 درصد رنگ در سدیم استات 50 mM با pH برابر 5.0، به مدت 2 تا 3 دقیقه و سپس آبکشی بود. پیش از هیبریداسیون، رنگ با SDS رقیق در SSPE قابل حذف بود.
نسخه امروزیِ پرکاربرد به این صورت اجرا می‌شود:
- RNA یا DNA دناتوره‌شده را به نایلون یا نیتروسلولز منتقل کنید، سپس با ایجاد پیوند عرضی به کمک UV یا حرارت‌دهی تثبیت کنید تا نمونه هنگام رنگ‌آمیزی از دست نرود.
- اختیاری، اما رایج: غشا را حدود 15 دقیقه در اسید استیک 5 درصد خیس کنید.
- به مدت 5 تا 10 دقیقه در محلول 0.02 تا 0.04 درصد متیلن بلو در سدیم استات 0.3 تا 0.5 M با pH نزدیک به 5.2 رنگ‌آمیزی کنید.
- به مدت 5 تا 15 دقیقه با آب آبکشی و رنگ‌زدایی کنید، تصویر را ثبت کنید، سپس پیش از هیبریداسیون رنگ باقی‌مانده را حذف کنید.
نایلون با بار مثبت، غشای غالب در کارهای نورترن است. نیتروسلولز نیز با همین روند استفاده از اسید استیک و استات کار می‌کند. تصویر برای تأیید انتقال، مقایسه نوارهای 28S و 18S یا 23S و 16S برای RNA باکتریایی، علامت‌گذاری نردبان‌ها و استانداردها، و نگهداری یک سابقه تقریبی برای نرمال‌سازی RNA کل استفاده می‌شود. روش‌های منتشرشده نورترن، نوارهای ریبوزومی رنگ‌آمیزی‌شده را برای بررسی بارگذاری کمی‌سازی می‌کنند؛ از جمله پژوهشی در علوم لبنیات که از نوارهای ریبوزومی رنگ‌آمیزی‌شده با متیلن بلو برای نرمال‌سازی استفاده کرده است. غشاهای ساترن را نیز می‌توان به همین شکل مشاهده کرد، اما کاربرد این رنگ به‌عنوان کنترل بارگذاری و انتقال در نورترن بسیار جاافتاده‌تر است. همچنین DNA در ساترن پیش از انتقال دناتوره می‌شود، بنابراین مقادیر حساسیت ژل را نمی‌توان به آن تعمیم داد.
حدهای آشکارسازی و پس‌زمینه: جایی که رنگ آبی عقب می‌ماند
مقایسه زیر عمداً تقریبی است. عملکرد رنگ به درصد ژل، پهنای نوار، تجهیزات نوری و دقت در رنگ‌زدایی بستگی دارد. هر عدد را نماینده یک مرتبه بزرگی در نظر بگیرید، نه یک مشخصه قطعی.
| رنگ و قالب | آشکارسازی تقریبی در هر نوار | تفسیر |
|---|---|---|
| متیلن بلو، dsDNA در آگارز | 40 تا 250 ng در شرایط بهینه؛ 0.5 تا 1 میکروگرم با برآورد محافظه‌کارانه | برای بارگذاری‌های آماده‌سازی نمونه و ژل‌های آموزشی کافی است. برای نوارهای کم‌مقدار ضعیف است. |
| متیلن بلو، ssDNA کوتاه یا RNA یا الیگونوکلئوتیدها در PAGE | تقریباً 0.1 تا 0.5 میکروگرم | وابسته به طول و ساختار. حد عمومی ندارد. |
| اتیدیوم بروماید، dsDNA در آگارز | حدود 1 تا 10 ng | در مقایسه فلورس، تقریباً چهار برابر حساس‌تر از رنگ آبی در شرایط بهینه بود. به UV نیاز دارد. |
| SYBR Green I، dsDNA | حدود 60 pg | تصویربرداری فلورسانس لازم است. |
| SYBR Gold، DNA و RNA | حدود 25 pg | در چند قالب، بیش از ده برابر حساس‌تر از اتیدیوم بروماید است. |
| رنگ‌آمیزی نقره، اسیدهای نوکلئیک در PAGE | حدود 0.3 تا 0.9 ng؛ مقدار 100 pg برای RNA در یک توالی بهینه رنگ‌آمیزی آبی و سپس نقره گزارش شده است | بسیار حساس، اما از نظر شیمیایی پیچیده و برای بازیابی نامناسب است. |
| تولوئیدین بلو، RNA و الیگونوکلئوتیدها در PAGE | مقادیر کاری در حد صدها ng، با مقدار مستند حدود 250 ng | مانند متیلن بلو با نور مرئی مشاهده می‌شود، اما حد استانداردشده‌ای قابل مقایسه با مشخصات SYBR ندارد. |
کنترل پس‌زمینه تعیین می‌کند که آیا این سیگنال محدود قابل استفاده است یا نه. رنگ آزاد بسیار پررنگ است، بنابراین کنتراست از حذف رنگ متصل‌نشده، بدون جدا کردن رنگ متصل‌شده، به دست می‌آید. محلول رنگ غلیظ‌تر به‌ندرت حساسیت را افزایش می‌دهد؛ عمدتاً زمان رنگ‌زدایی را بیشتر می‌کند. یک سری رقت را روی همان ژل، غشا و دوربین مورد استفاده آزمایش کنید و فقط از محدوده‌ای استفاده کنید که چگالی انتگرال‌گیری‌شده با مقدار ورودی متناسب می‌ماند. متیلن بلو برای نرمال‌سازی نیمه‌کمی بارگذاری کاربرد دارد. این روش یک سنجش کمی با دامنه دینامیکی بالا نیست، زیرا ظرفیت غشا، بازده انتقال، اشباع و رنگ‌زدایی از مسیری به مسیر دیگر تغییر می‌کنند.
محدودیت‌های سازگاری: چه چیزهایی پس از رنگ‌آمیزی قابل استفاده می‌مانند
کلون‌سازی پس از رنگ‌آمیزی آبی نشان داده شده است. فلورس و همکاران، نوارهای رنگ‌آمیزی‌شده آگارز را برش دادند، DNA را بازیابی کردند و پس از لیگاسیون و ترانسفورماسیون، کلون‌سازی بهتری نسبت به روش اتیدیوم بروماید همراه با UV گزارش کردند. دلیل احتمالی، آسیب نوری کمتر است، نه فایده‌ای ناشی از خود رنگ. نوردهی با نور سفید را کوتاه نگه دارید و DNA بازیابی‌شده را با یک روش معمول پاک‌سازی استخراج از ژل تصفیه کنید.
شواهد برای PCR و تعیین توالی محدودتر است. رنگ باقی‌مانده به اسیدهای نوکلئیک متصل می‌شود، بنابراین پیش از مراحل آنزیمی رنگ‌زدایی و پاک‌سازی کنید. انتظار می‌رود DNA که از ژل آبی به‌درستی خالص‌سازی شده است قابل استفاده باشد، اما میزان تحمل ورود مستقیم رنگ باقی‌مانده در پلی‌مرازهای مختلف و سامانه‌های شیمیایی تعیین توالی به‌خوبی کمی‌سازی نشده است. آن را مسلم فرض نکنید.
هیبریداسیون بلات زمانی سازگار است که ترتیب دقیق رعایت شود: انتقال، تثبیت، رنگ‌آمیزی، ثبت تصویر، رنگ‌زدایی، هیبریداسیون. این توالی همان طراحی هرین و اشمیت است. رنگ‌آمیزی پیش از انتقال یا حذف مرحله رنگ‌زدایی، روشی متفاوت است و به اعتبارسنجی مستقل نیاز دارد. پس از حذف رنگ، حذف پروب و پروب‌گذاری مجدد طبق روال استاندارد انجام می‌شوند. برای رنگ‌آمیزی در سطح سلولی با همین خانواده رنگ‌ها و اینکه چرا منطق نمونه‌های تثبیت‌شده به روش‌های سلول زنده قابل تعمیم نیست، اطلس رنگ‌آمیزی میکروسکوپی را ببینید.
برش نوار برای آماده‌سازی نمونه از آگارز و نیز برای الیگونوکلئوتیدهای PAGE که با رنگ آبی شناسایی شده‌اند امکان‌پذیر است، به شرط آنکه از نسخه تثبیت دائمی استفاده نشود. الکتروالوشن پس از رنگ‌زدایی، برای یک ماده اتصال‌یابنده برگشت‌پذیر از نظر شیمیایی محتمل است، اما داده‌های کنترل‌شده درباره بازده آن به‌طور خاص برای متیلن بلو اندک‌اند. پس از الوشن، نمک‌زدایی یا رسوب‌دهی انجام دهید.
خطاهایی که تکرار می‌شوند
نوارهای کم‌رنگ ژل معمولاً نشان می‌دهند که جرم نمونه برای یک رنگ‌آمیزی رنگ‌سنجی کافی نیست، به‌ویژه برای اهداف کوتاه تک‌رشته‌ای یا RNA. مقدار بیشتری بارگذاری کنید، از محلول رنگ تازه استفاده کنید، پیش از افزایش غلظت زمان رنگ‌آمیزی را بیشتر کنید و رنگ‌زدایی را زودتر متوقف کنید. ژلی کاملاً آبی و بدون کنتراست معمولاً نشان‌دهنده رنگ‌آمیزی بیش از حد یا تعداد ناکافی تعویض آب است. محو شدن نوارهای PAGE نتیجه قابل انتظار شیمی این روش است، نه شکست رنگ‌آمیزی. سریع عکس بگیرید. پس‌زمینه ناهموار غشا به چین‌خوردگی، حباب، اثر انگشت، تکان‌دادن نامنظم یا انتقال لکه‌ای اشاره دارد. بدون کنترل هیبریداسیون، آن را نشانه بارگذاری نابرابر تلقی نکنید. الگوی ریبوزومی ضعیف و کشیده می‌تواند نشانه تخریب باشد، اما همچنین ممکن است از انتقال ناقص، مقدار بسیار کم RNA کل، یا رنگ‌زدایی بیش از حد ناشی شود؛ مسیرهای معمول چند تا چند ده میکروگرم نمونه دارند. رنگ، RNA ریبوزومی فراوان را نشان می‌دهد. رونوشت مشخصی را نشان نمی‌دهد. آن کار بر عهده پروب است.
ایمنی و کار با ماده، بدون اغراق
کار با متیلن بلو ساده‌تر از اتیدیوم بروماید است، اما این ماده بی‌خطر نیست. برگه اطلاعات ایمنی فعلی MilliporeSigma، این رنگ را در رده 4 سمیت حاد خوراکی طبقه‌بندی می‌کند؛ در صورت بلع زیان‌آور است و طبق برگه اطلاعات ایمنی متیلن بلو Sigma-Aldrich، باید از مسیر تأییدشده دفع پسماند دور ریخته شود. اتیدیوم بروماید هشدارهای شدیدتری درباره سمیت ژنتیکی دارد، از جمله اثرات مشکوک بر سلول‌های زایا در برگه اطلاعات ایمنی اتیدیوم بروماید Sigma-Aldrich. همچنین ژل‌ها و محلول‌های آن معمولاً به‌عنوان پسماند شیمیایی خطرناک جداگانه جمع‌آوری می‌شوند، همان‌طور که در راهنمای رنگ‌های اسید نوکلئیک Thermo Fisher آمده است. برای هر دو ماده، از برگه اطلاعات ایمنی و مقررات مؤسسه پیروی کنید. رنگ خشک را در ظرف کاملاً بسته و خشک نگه دارید، محلول رنگ کاری را فقط در حدی که پروتکل اجازه می‌دهد دوباره استفاده کنید، غشاهای رنگ‌آمیزی‌شده را به‌صورت خشک بین ورقه‌های کاغذ صافی نگهداری کنید و پیش از آنکه نوارها بر اثر انتشار محو شوند، از ژل‌ها عکس بگیرید.
این جمله کاربردی آزمایشگاهی را به خاطر بسپارید: ژل‌ها قابلیت مشاهده را در بارگذاری بالا و زیر نور سفید می‌سنجند. غشاها انتقال و بارگذاری را بررسی می‌کنند، پیش از آنکه پروب کار حساس آشکارسازی را انجام دهد. یک رنگ برای هر دو کاربرد به کار می‌رود، با حساسیت محدود، اتصال برگشت‌پذیر و ترتیب دقیق مراحل.