تفسیر ظاهر کلنی‌های E. coli و دیگر میکروارگانیسم‌ها روی آگار EMB

دانشجویی یک نمونهٔ ناشناخته را روی آگار ائوزین متیلن بلو به روش خطی کشت می‌دهد، آن را یک شب انکوبه می‌کند و روز بعد با پلیتی از کلنی‌های تیره با درخششی سبز روبه‌رو می‌شود. در دفتر یادداشت می‌نویسد: «E. coli، تأیید شد.» این یادداشت ادعایی فراتر از شواهد پلیت دارد. پلیت، فنوتیپ رشد و تخمیر را در شرایطی مشخص نشان می‌دهد. تعیین هویت گونه ادعایی جداگانه است که به شواهد جداگانه نیاز دارد.

این راهنما نتایج آگار EMB را موضوعی برای تفسیر می‌داند. مبنای آن را توضیح می‌دهد، یک اطلس تصویری از پلیت‌ها را همراه با کنترل‌ها مرور می‌کند و مواردی را مشخص می‌کند که تصویر کتاب‌های درسی گمراه‌کننده است.

مبنای عملکرد پلیت

آگار EMB هم انتخابی است و هم افتراقی. رنگ‌های ائوزین Y و متیلن بلو رشد بسیاری از میکروارگانیسم‌های گرم‌مثبت را مهار می‌کنند؛ بنابراین این محیط رشد گرم‌منفی‌ها را ترجیح می‌دهد. همین رنگ‌ها نقش شناساگر نیز دارند: وقتی میکروارگانیسم قند موجود را تخمیر می‌کند و به‌اندازهٔ کافی اسید موضعی تولید می‌کند، کلنی مقدار زیادی رنگ جذب می‌کند و به رنگ بنفش تیره تا آبی‌سیاه درمی‌آید. با تولید شدید اسید، سطح کلنی ممکن است جلای رنگین‌تاب سبز فلزی نشان دهد. پروتکل ASM برای پلیت‌های آگار ائوزین متیلن بلو این ترکیب انتخاب و افتراق را توضیح می‌دهد و عکس‌های مرجع برای آموزش ارائه می‌کند.

پیش از تفسیر هر نتیجه، یک نکته اهمیت دارد: بررسی کنید کدام فرمولاسیون استفاده شده است. فرمولاسیون قدیمی‌تر Holt Harris Teague حاوی لاکتوز و ساکاروز است، درحالی‌که Levine EMB فقط لاکتوز دارد. میکروارگانیسمی که ساکاروز را تخمیر می‌کند اما لاکتوز را نه، مانند بسیاری از جدایه‌های Serratia marcescens، ممکن است روی این دو نسخه ظاهر متفاوتی داشته باشد. مستندات سازنده دربارهٔ محیط‌های EMB این تفاوت فرمولاسیون را به‌صراحت بیان می‌کند. نام سازنده و فرمولاسیون را همراه با نتیجه در دفتر یادداشت ثبت کنید.

آگار EMB آماده و تلقیح‌نشده معمولاً قرمز‌قهوه‌ای تا بنفش مایل به قرمز است و گاهی ته‌رنگ سبز یا رسوب ریز دارد. این رنگ زمینه نشانهٔ رشد نیست. هر مشاهده را با یک پلیت تلقیح‌نشده یا وضعیت پایهٔ ثبت‌شده مقایسه کنید و، مگر آنکه پروتکل آموزشی دستور دیگری بدهد، پلیت اولیه را پس از حدود 18 تا 24 ساعت انکوباسیون هوازی در دمای 35 تا 37 C بررسی کنید. انکوباسیون طولانی‌تر می‌تواند ظاهر ناشی از تخمیر را تغییر دهد.

چگونه پلیت را بررسی کنیم

از دو نوع نور استفاده کنید. ابتدا پلیت را زیر نور بازتابی یا مایل بررسی کنید و آن را کج کنید: جلای فلزی رنگین‌تاب است و ممکن است با تغییر زاویهٔ دید ظاهر یا ناپدید شود. سپس آن را با نور عبوری بررسی کنید تا رنگ کلنی و مراکز تیره را ارزیابی کنید. بررسی را بر پایهٔ کلنی‌های به‌خوبی جدا از هم انجام دهید، زیرا تراکم و کلنی‌های مجاور تجمع موضعی اسید را تغییر می‌دهند و می‌توانند رنگ را تضعیف یا تشدید کنند. مجموعه تصاویر ASM این موضوع را مستقیماً نشان می‌دهد: E. coli در کشت مخلوط ممکن است جلای مورد انتظار خود را از دست بدهد، زیرا میکروارگانیسم‌های اطراف محیط اسیدی را تغییر می‌دهند.

هر زمان که تمرین اجازه می‌دهد، کنترل‌ها را نیز به کار ببرید. یک مجموعهٔ آموزشی رایج شامل E. coli ATCC 25922 برای فنوتیپ آبی‌سیاه با جلای فلزی، یک میکروارگانیسم غیرتخمیرکننده مانند Salmonella Typhimurium ATCC 14028 یا Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 برای فنوتیپ بی‌رنگ، و یک میکروارگانیسم گرم‌مثبت مانند Enterococcus faecalis یا Staphylococcus aureus به‌عنوان کنترل مهار رشد است؛ همان‌طور که در جدول‌های استاندارد کنترل کیفیت محیط‌های EMB آمده است. اگر کنترل مثبت جلا ندارد، پیش از تردید دربارهٔ نمونهٔ ناشناخته، انکوباسیون، تراکم کلنی‌ها یا فرمولاسیون را بررسی کنید.

اطلس تصویری پلیت‌ها

پلیت‌های زیر تصویرسازی‌های تولیدشده‌اند، نه عکس‌هایی از کشت‌های واقعی. آن‌ها الگوی مورد جست‌وجو را نشان می‌دهند، نه طیف رنگ دقیق یک سویهٔ خاص را. آن‌ها را با عکس‌های مرجع ASM و پلیت‌های واقعی آزمایشگاه آموزشی مقایسه کنید.

پلیت 1: Escherichia coli روی آگار EMB، تخمیرکنندهٔ قوی لاکتوز

E. coli روی آگار EMB معمولاً بنفش تیره تا آبی‌سیاه است و اغلب مرکزی تیره و جلای سبز فلزی ناشی از تولید شدید اسید دارد. این جلا همان یافتهٔ معروفی است که دانشجویان به دنبال آن می‌گردند، اما آن را شاهدی پشتیبان بدانید، نه ویژگی تعریف‌کننده. شدت جلا با سویه، زمان انکوباسیون، تراکم کلنی‌ها و زاویهٔ دید تغییر می‌کند. نبود جلا، وجود E. coli را رد نمی‌کند و کلنی تیرهٔ بدون جلا می‌تواند به چندین تخمیرکنندهٔ دیگر نیز اشاره داشته باشد. برای هر بررسی تکمیلی، به‌جای تکیه بر مشاهدهٔ یک بخش متراکم، کلنی‌ای به‌خوبی جدا از سایر کلنی‌ها انتخاب کنید.

پلیت 2: Klebsiella pneumoniae روی آگار EMB، تخمیرکنندهٔ موکوئیدی

Klebsiella pneumoniae روی آگار EMB معمولاً کلنی‌های بزرگ، براق و موکوئیدی با طیف رنگ صورتی‌بنفش تا قهوه‌ای‌بنفش ایجاد می‌کند؛ این کلنی‌ها اغلب مراکز تیره دارند، اما معمولاً جلای فلزی قوی ندارند. ریخت‌شناسی مشابهی در تخمیرکننده‌های مرتبط مانند Enterobacter نیز دیده می‌شود. بافت موکوئیدی و اندازهٔ کلنی بخشی از تفسیر هستند: ارزش تفسیری یک کلنی صورتی کوچک و مسطح با یک کلنی بزرگ، گنبدی و موکوئیدی متفاوت است. همانند E. coli، پلیت یک فنوتیپ تخمیر را مطرح می‌کند و نام‌گذاری در سطح گونه به تأیید بیوشیمیایی نیاز دارد که در ادامه توضیح داده می‌شود.

پلیت 3: Salmonella روی آگار EMB و دیگر غیرتخمیرکننده‌ها، کلنی‌های بی‌رنگ

Salmonella روی آگار EMB و میکروارگانیسم‌های مرتبطی که لاکتوز را تخمیر نمی‌کنند، از جمله Shigella و بسیاری از جدایه‌های Pseudomonas، معمولاً به‌صورت کلنی‌های بی‌رنگ تا نیمه‌شفاف یا کهربایی کم‌رنگ رشد می‌کنند. برخی فرمولاسیون‌ها و شرایط، ته‌رنگ صورتی خفیفی ایجاد می‌کنند؛ بنابراین یک کلنی صورتی کم‌رنگ لزوماً تخمیرکننده نیست. EMB نمی‌تواند Salmonella را از Shigella یا سایر غیرتخمیرکننده‌ها متمایز کند؛ این تمایز به آزمون‌های بعدی وابسته است. همچنین توجه کنید که سویه‌های لاکتوزمثبت Salmonella با کلنی‌های فلزی شبیه E. coli گزارش شده‌اند؛ این هم دلیل دیگری است که یک پلیت به‌تنهایی نمی‌تواند نتیجه را قطعی کند.

پلیت 4: Serratia marcescens و دام فرمولاسیون

Serratia marcescens به بخش جداگانه‌ای نیاز دارد، زیرا دانشجویان اغلب انتظار کلنی‌های قرمز دارند و سپس پلیت را اشتباه تفسیر می‌کنند. بیشتر جدایه‌های بالینی لاکتوز را تخمیر نمی‌کنند؛ بنابراین روی Levine EMB معمولاً کم‌رنگ یا با رنگ‌پذیری ضعیف دیده می‌شوند. از آنجا که بسیاری از جدایه‌ها ساکاروز را تخمیر می‌کنند، فرمولاسیون حاوی ساکاروز ممکن است واکنشی تیره‌تر یا بیشتر مرتبط با تولید اسید ایجاد کند. در دمای 35 تا 37 C نیز انتظار رنگدانهٔ قرمز کلاسیک پرودیجیوزین را نداشته باشید؛ تولید رنگدانه در دمای انکوباتور قابل اتکا نیست. وقتی پروتکل از Serratia marcescens روی آگار EMB نام می‌برد، بررسی کنید که آن عبارت کدام فرمولاسیون را مفروض گرفته است. مروری بر متابولیسم Serratia الگوی لاکتوزمنفی و تخمیر متغیر ساکاروز را که پشت این دام قرار دارد، خلاصه می‌کند.

پلیت 5: کنترل‌ها و میکروارگانیسم‌های مهارشده

میکروارگانیسم‌های گرم‌مثبت مانند Staphylococcus، Enterococcus، Streptococcus و Bacillus معمولاً روی آگار EMB مهار می‌شوند یا رشدشان به‌شدت کاهش می‌یابد، هرچند مهار برای همهٔ سویه‌ها مطلق نیست. یک مجموعهٔ کنترل، تفسیر را قابل اتکا می‌کند: کنترل E. coli باید رشد خوبی با رنگ آبی‌سیاه و جلا نشان دهد، کنترل غیرتخمیرکننده باید رشد بی‌رنگ داشته باشد و کنترل مهار رشد باید رشد اندک یا هیچ رشدی نشان دهد. اگر کنترل مهار رشد به‌خوبی رشد کند، عملکرد انتخابی محیط ناموفق بوده و همهٔ تفسیرهای دیگر از همان سری محیط زیر سؤال می‌روند. روش‌های رنگ‌آمیزی به پرسشی متفاوت از محیط‌های کشت پاسخ می‌دهند؛ برای بخش رنگ‌آمیزی لام در آزمایشگاه، به اطلس رنگ‌آمیزی متیلن بلو مراجعه کنید.

مقایسه با حدود مشخص

سه جمله ظاهرهای گمراه‌کننده را خلاصه می‌کند. تیرگی به معنای E. coli نیست، زیرا Klebsiella، Enterobacter و دیگر تخمیرکننده‌ها مراکز تیرهٔ بدون جلا ایجاد می‌کنند. صورتی بودن به معنای Klebsiella نیست، زیرا تخمیرکننده‌های متوسط یا کند و برخی میکروارگانیسم‌هایی که معمولاً غیرتخمیرکننده محسوب می‌شوند، صورتی یا بنفش کم‌رنگ دیده می‌شوند. جلا به معنای شناسایی قطعی E. coli نیست، زیرا سایر تخمیرکننده‌های قوی نیز می‌توانند آن را ایجاد کنند. پروتکل آموزشی و تصاویر کشت مخلوط آن هر یک از این خطاها را نشان می‌دهند.

محدودیت‌های تأیید شناسایی

آگار EMB یک فنوتیپ را نشان می‌دهد، نه یک گونه را. میکروارگانیسم‌های مختلف می‌توانند ظاهر کلنی یکسانی داشته باشند و یک میکروارگانیسم نیز ممکن است بسته به سویه، سن کشت، تراکم، فرمولاسیون و انکوباسیون از تصویر کتاب درسی خود فاصله بگیرد. به همین دلیل، در روندهای آموزشی و بالینی، ریخت‌شناسی روی EMB مبنای شناسایی احتمالی تلقی می‌شود.

یک روند کاری قابل دفاع برای دانشجو چنین است: کلنی جداشده را توصیف کنید (اندازه، رنگ، مرکز، جلا زیر نور مایل و ویژگی موکوئیدی)، فرمولاسیون، زمان و دمای انکوباسیون و کنترل‌ها را ثبت کنید؛ سپس پیش از هر آزمون تأییدی، از یک کلنی به‌خوبی جدا از سایر کلنی‌ها کشت مجدد تهیه کنید تا کشت خالص به دست آید. بررسی‌های تکمیلی رایج شامل رنگ‌آمیزی گرم همراه با واکنش‌های IMViC برای شناسایی احتمالی E. coli و کلی‌فرم‌ها، TSI یا KIA و مجموعه آزمون‌های بیوشیمیایی اختصاصی میکروارگانیسم برای میکروارگانیسم‌های روده‌ای است؛ در مواردی که کار اقتضا کند، روش‌های سرولوژیک، MALDI TOF یا سایر روش‌های شناسایی اعتبارسنجی‌شده نیز به کار می‌روند. برای آشنایی با جایگاه EMB در میان محیط‌های انتخابی و افتراقی روده‌ای، به مطالب مقدماتی دربارهٔ محیط‌های کشت روده‌ای و بررسی تکمیلی با رنگ‌آمیزی گرم مراجعه کنید. دربارهٔ پرسش مرتبطِ اینکه رنگ‌آمیزی آبی لام چه چیزی را می‌تواند و چه چیزی را نمی‌تواند اثبات کند، اطلس رنگ‌آمیزی متیلن بلو نیز با همین رویکرد مشاهده را از نتیجه‌گیری جدا نگه می‌دارد.

مشاهده را پیش از نتیجه‌گیری بنویسید. عبارت «کلنی‌های آبی‌سیاه تیره با جلای سبز وابسته به زاویهٔ دید روی Levine EMB پس از 24 ساعت، سازگار با تخمیر شدید لاکتوز» قابل دفاع است. عبارت «E. coli، تأیید شد» به مرحلهٔ تأییدی نیاز دارد که پلیت به‌تنهایی نمی‌تواند فراهم کند.