Nork garatu zuen odolaren tindaketa morea? Malachowski, Romanowsky, Giemsa

Eosina gorria da. Metileno-urdina urdina da. Nahasi biak, aplikatu nahasketa odol-geruza lehortu batean, eta geruzaren zati batzuk more bihurtzen dira.

Ez zati guztiak. Prestakin on batean, globulu zurien nukleoek kolore gorri-morea hartzen dute, eta malaria-parasito baten barruan kromatinak kolore bera hartzen du; inguruko globulu gorriek, berriz, arrosa izaten jarraitzen dute, eta zitoplasmak gris-urdin. Moreak aukera ematen du zelula motak elkarrengandik bereizteko.

Bi botiletako batek ere ez du morea. Kolorea metileno-urdinaren deskonposizio-produktu jakin bat portaobjektuan eosinarekin elkartzen denean soilik agertzen da, eta 1880ko eta 1890eko hamarkadetan inork ez zekien produktu hori existitzen zenik, are gutxiago zer zen. Kolorearen bila zebiltzanek tindagai ezpuruekin lan egiten zuten, bakarka, botila batean zer zegoen modu fidagarrian jakiteko aukerarik gabe, apal batean bi hilabete eman ondoren.

Horregatik, izenburuko galderak erantzun defendagarri bat baino gehiago du, eta horregatik aldatu zen erantzuna 2011n.

Nahasketarekin batera aldatzen zen emaitza

Tindaketa ez zen asmatu. Ekarpenak pilatuz osatu zen. Nahasketaren aldaketa bakoitzak informazio ikusgarri berri bat zekarren, eta informazio horren sekuentzia da historia ulertzeko modurik argiena.

Urtea	Zer zegoen ontzian	Zer ikus zitekeen
1865	Azido pikrikoa, odolari aplikatutako lehen tindagai sintetikoa, Wilhelm Erbek erabilia	Parpailaren antzeko egitura globulu gorri batzuen barruan.
1876	Metileno-urdina, Heinrich Carok eta Adolf von Baeyerrek BASFen garatua	Tuberkulu-baziloak, Robert Kochen eskuetan. Odol-zelulak urdin-tonu bakarrean.
1880	Metileno-urdina eta fuksina azidoa, Ehrlichen tindaketa neutroa	Globulu gorriak eta eosinofiloen granuluak gorri, nukleoak urdin bizi, linfozitoen zitoplasma urdin zurbil, eta bi tindagaiak hartzen zituzten granulu bioleta ilunak. Horregatik deitzen zaio zelulari neutrofilo. Globulu zurien lehen zenbaketa diferentziala.
1888	Metileno-urdina eta eosina. Czesław Chęciński	Parasitoa bera: margarita-itxurako forma urdinak (Plasmodium malariae) eta igitai-itxurako formak (P. falciparum gametozitoak). Ez haren nukleoa.
1890	Metileno-urdin gehiago, alkohol gutxiago eta potasio hidroxidoa. Albert Plehn	Kolore sorta zabalagoa eta biziagoa, tartean globulu gorri arrosak eta eosinofiloen granulu arrosak. Oraindik gorria eta urdina bakarrik.
1890	Eosina eta boraxarekin alkalinizatutako metileno-urdina. Ernst Malachowski	Kromatina gorri-morea parasitoaren barruan, nukleoa zitoplasmatik bereizita. Nahita lortua, eta, haren arabera, erreproduzigarria.
1891	Eosina eta bi hilabete baino gehiagoko botila lizundu bateko metileno-urdina. Dmitri Romanowsky	More bera, behin, besteek errepikatu ezin zuten metodo baten bidez.
1898tik 1902ra	Kloroformoz erauzitako tindagai polikromoa (Nocht); metanola (Jenner); hauspeakina alkoholean berriz disolbatzea (Leishman, Reuter, Wright); tindagaiak kantitate neurtuetan, glizerolarekin (Giemsa)	Morea behar zen bakoitzean, hurrengo laborategian ere berdin jokatzen zuen produktu batean. Jennerren bertsioak, tindagai polikromaturik gabe, ez zuen morerik ematen.
1940tik 1943ra	Lilliek, Roek eta Wilcoxek osagaiak bereizi eta banan-banan probatu zituzten	Azure B da morea sortzen duen osagaia, ez nahasketa.

Azken zutabeko eredua da garrantzitsuena. Aurrerapen bakoitzak kolore sorta zabaldu zuen, eta zabaltze bakoitzak beste egitura bat jarri zuen ikusgai. Morea ez da teknikaren apaingarri bat; parasito bat badagoela ikustearen eta zertaz osatuta dagoen ikustearen arteko aldea da. Tindagaia bera BASFen tindagai-fabrika batetik medikuntzara nola iritsi zen historia luzeagoa da, bere dokumentuak dituena. Goiko sekuentzia osoa, sarrera bakoitzaren iturriarekin batera, iturriei lotutako ekarpenen kronologia batean dago jasota.

Irudia: sei nahasketa berak, ontzian zegoena eta hartatik ateratzen zena erakusteko marraztuta. Zirkuluek tindagaiak adierazten dituzte; azpiko blokeek, tindagai horiek odol-geruza batean sor zitzaketen koloreak. 1890 baino lehen ez dago bloke gorri-morerik, eta hortik aurrera ez da halakorik falta.

Boraxa nahita erabili zuen gizona

Ernst Malachowski Breslauko medikua zen, gaur egungo Wrocławen. Bere ibilbidea kontsulta pribatuan eta lankide batekin zuzentzen zuen klinika txiki batean egin zuen, eta laborategiko lana bere denbora librean egiten zuen. Strzelnon jaio zen, 1857ko martxoaren 12an, medikuntza ikasi zuen Breslauko Unibertsitatean, eta 1882tik 1887ra barne-medikuntzako laguntzaile gisa lan egin zuen Santu Guztien Ospitalean, garai hartan Alemaniako bigarren ospitalerik handienean.

1888an hasi zen Chęciński eta Plehnen tindaketa bikoitzarekin. 1889an egindako prestakin batean, plasmodioaren nukleoko kromatina zitoplasma ez bezala tindatzen zela ikusi zuen, baina gero ezin izan zuen emaitza errepikatu. Metileno-urdina azidotzen saiatu zen, eta horrek emaitzak okertu zituen. Boraxarekin alkalinizatzen saiatu zen, eta horrek aldi guztietan funtzionatu zuen. Metodoa jendaurrean erakutsi zuen 1890eko ekainaren 15ean, eta deskribapen osoago bat argitaratu zuen 1891ko abuztuan, boraxa erabiltzeko jarraibidea barne. Adierazi zuen tindaketak hogeita lau ordu behar zituela eta emaitzak erraz erreproduzitzen zirela.

Hogeita lau ordu denbora luzea da diagnostiko-laborategi batean, eta haren artikuluak ez zuen parasitoaren nukleoaren kolore more-gorria sakon aztertu. Arrazoia edozein izanik ere, inork ez zuen metileno-urdina nahita alkalinizatzeko bidea hartu, Nochtek 1898an berriz egin zuen arte. Malachowskik ez zuen odol-tindaketari buruz berriro idatzi.

Duela gutxi arte hari buruz hain gutxi jakitearen arrazoia artxiboetan dago, ez misterio batean. Haren bizitzaren ia arrastorik ez zen gelditu literatura medikoan, eta gelditu zena bide bakar batetik iritsi zen. Marie alabak Alemania utzi eta Londresera jo zuen 1939an, Britainiar Armadan zerbitzatu zuen eta Kanadan finkatu zen; familiaren dokumentuen bilduma New Yorkeko Leo Baeck Institutuan amaitu zen. Leo anaia Lehen Mundu Gerran hil zuten. Eva ahizpa Breslautik Izbicako igarotze-esparrura deportatu zuten 1942ko apirilean, eta ez zen inoiz itzuli. Hedwig amak bere buruaz beste egin zuen 1942ko apirilaren 22an, deportazio bera gertatu arte itxaron beharrean. Malachowski 1934an hil zen, hori guztia gertatu baino lehen.

Horrela amaitzen den familia baten historia aipatzeari utzi egiten zaio. Malachowski tindaketaren garapenaren historian berriz kokatu zuten bi artikuluak, biak 2011n argitaratuak, Poznań eta Wrocławeko artxibo-dokumentuetatik eta Marieren New Yorkeko dokumentuetatik osatu ziren.

Botila lizundu bat eta zorte oneko errusiar bat

Dmitri Romanowskyk medikuntza ikasi zuen San Petersburgoko Medikuntza Akademia Militarrean, eta bere ibilbidearen zatirik handienean malaria ikertu zuen. 1890ean, paperean Chęcińskirenaren ia berdina zen metodo bat argitaratu zuen: aldatu gabeko metileno-urdina eta eosina, eosina pixka bat gehiagorekin.

1891ko irailean argitaratu zuen ospea eman zion metodoa, eta xehetasun garrantzitsua jarraibideen artean ezkutatuta zegoen. Emaitzarik onenak die vorräthige Methylenlösung izenekotik lortu zituen: bi hilabete baino gehiagoz geldirik egondako metileno-urdinaren erreserba-disoluzio bat zen, lizuna hazten ari zitzaiona. Lizunak eta geldirik emandako denborak tindagaia partzialki desmetilatu zuten. Romanowskyk ez zekien hori eta ezin zuen kontrolatu; haren metodoa probatu zuten beste ikertzaileek ezin zuten morea lortu. Tesia San Petersburgon aurkeztu zuen 1891ko ekainean; horregatik, ohiko kontakizunak 1891 hartzen du aurkikuntzaren urtetzat.

Malachowskiren erakustaldia 1890eko ekainean izan zen, urtebete baino lehenago, eta haren metodoak nahita ematen zuen emaitza.

Zergatik hartu zuen tindaketak okerreko gizonaren izena

Malachowskiren aldeko argudioak Kristine Kraftsek, Ernst Hempelmannek eta Barbara Oleksynek bildu zituzten, eta lau oinarri dituzte. Jendaurreko erakustaldiaren data: 1890eko ekaina, 1891ko irailaren aldean. Nahita hitza, ustekabean hitzaren aldean. Malachowskik bere metodoa argitaratu izana, boraxa eta guzti, Romanowskyrena kontrolatu gabeko aldagai baten mende zegoen bitartean. Eta plasmodioaren nukleoaren deskribapena, hura agerian jartzen zuen morearekin batera, literaturatik ia erabat zazpi urtez desagertu izana, inork ezin zuelako ustekabeko bertsioa erreproduzitu.

Ondorioa zuzen eta garbi adierazten dute. Artikulu biografikoan, egiletzaren esleipenari «bidegabekeria» deitzen diote, eta Ralph Lillie aipatzen dute; hark 1978an idatzi zuen «agian tindaketa-familia honi Malachowski tindaketak deitu beharko geniokeela».

Aldarrikapena eztabaidatua da, lehentasun-aldarrikapenak izan ohi diren bezala, eta eztabaidaren nondik norakoak azaltzea merezi du, ebaztea baino gehiago. Lehentasunari buruzko argudio batek aurkikuntza zer izan zen zehaztu behar du. Aurkikuntza kolore morea bada, Malachowskik du lehenagoko erakustaldi dokumentatua. Aurkikuntza argitaratutako metodoa bada, biek argitaratu zuten 1891n, eta tindaketak Romanowskyren izena hartu zuen. Aurkikuntza azalpena bada, bietako batek ere ezin du meritua bereganatu, inork ez baitzekien heltzea desmetilazioa zenik, eta inork ezin baitzuen esan zergatik agertzen zen kolorea. Azken puntu hori da dibulgazio-kontakizunek baztertzen dutena. Osagai aktiboa inork identifikatu gabeko ezpurutasun bat zen, eta kolorea nahita sortu zuen lehen pertsonak errezeta enpiriko erreproduzigarri baten bidez egin zuen, ez errezetak zer egiten zuen ulertuta.

2011ko bi artikuluak dira Malachowskiren alde argitaratutako azalpenik osoena, eta biak doan irakur daitezke PubMeden: berrikuspen luzea PMID 21235291 helbidean eta artikulu biografikoa PMID 21660627 helbidean. Berrikuspenaren PubMed erregistroak hari buruzko iruzkin bat ere jasotzen du, urte berean geroago aldizkari berean argitaratua, 86(5):366 erreferentziarekin; horrek gogorarazten du argudioa argitaratu bezain laster eztabaidatu zela argitalpenetan.

Eztabaida ez da kimikari buruzko desadostasuna. Parte-hartzaile guztiak ados daude morea zer den eta zer osagaik sortzen duten. Desadostasuna nork lortu zuen lehenengo da, eta ea inork errepikatu ezin izan zuen ustekabeko emaitza lortutzat har daitekeen.

Zer ekarri zuten geroko izenek

Malachowskik morea lehenengo sortu bazuen, zergatik daramatza tindaketak Romanowsky, Wright eta Giemsaren izenak?

Asmatzailearen eskuetan behin funtzionatzen duen tindaketa bat ez delako erreaktibo bat. Geroko lanak nahasketa aldakor bat beste herrialde bateko teknikari batek astearte batean erabil zezakeen zerbait bihurtu zuen.

Nocht arrazoituz iritsi zen emaitzara. Tindagai neutro soil batekin emaitza fidagarririk lortu ez zuenez, ondorioztatu zuen morea metileno-urdinean zegoen baina metileno-urdina ez zen zerbaitetik etorri behar zela, eta haren bila hasi zen. Unnak ordurako ikusia zuen zahartutako metileno-urdinaren disoluzioek mastozitoen granuluak gorriz tindatzen zituztela, eta proposatua zuen tindagaia heltzean substantzia berri bat sortzen zela. Bernthsenek 1885ean erakutsi zuen baldintza alkalinoek metileno-urdinari metilo taldeak kentzen dizkiotela, eta produktu horiek direla gaur egun azur deitzen ditugunak. Nochtek frakzio aktiboa kloroformoz erauzi zuen, eta Rot aus Methylenblau, metileno-urdinetik ateratako gorria, besterik ezin izan zion deitu; Michaelisek azur I izena eman zion 1901ean. Jennerrek logistika konpondu zuen. Metileno-urdinaren eta eosinaren hauspeakina metanol absolutuan berriz disolbatzeak disoluzio egonkor bakarra eman zuen, geruza tindatu ahala finkatzen zuena eta bero bidezko finkapena baztertzea ahalbidetu zuena. Leishmanek eta Reuterrek tindagai polikromatua disolbatzaile alkoholiko batekin konbinatu zuten, eta egonkortasuna eta morea batera lortu zituzten. Wrightek 65 °C-an hamabi orduko inkubazioa eta hamar eguneko pausatzea ordezkatu zituen, lurrun-korrontean ordubete erabiliz. Giemsaren metodoak ez zuen jada ausaz heldutako disoluziorik behar: tindagai ezagunen kantitate neurtuak erabiltzen zituen, metanolean glizerola gehituta, produktuak bero tropikala jasan zezan. Ez zuen inoiz argitaratu metileno-azur purua nola egiten zuen. Leipzigeko Dr Grüblerren laborategiari saldu zion; laborategiak azur I izenarekin merkaturatu zuen, eta bere bertsioa bakarrik zela benetako Giemsa tindagaia aldarrikatu zuen.

Azur horren identitatea oraindik eztabaidatzen da. Batzuek diote metileno-urdin polikromatua besterik ez zela; beste batzuek, azure B ugari zuela. Erantzuna gerra baten ondorioz iritsi zen. Alemaniako tindagaiak lortu ezin zirenean, Estatu Batuetako Osasun Publikoko Zerbitzuko talde batek, Ralph Lilliek Maurice Roe eta Aimee Wilcoxekin batera, aurkitu zuen tindaketarik onena hiru osagai bereizirekin lortzen zela: aldatu gabeko metileno-urdina, haren deskonposizio-produktu desmetilatua, azure B, eta eosina. Azure B erabili zen eskuratu ezin zen azur I ordezkatzeko, eta hiru osagai horiek dira oraindik gaur egun malaria diagnostikatzeko erabiltzen den tindaketaren oinarria.

Hiru osagai horiek portaobjektuan nola elkarreragiten duten beste galdera bat da, beste orri batean aztertua. Romanowsky motako tindaketetan tindagaiek dituzten eginkizunak eta kimika azaltzen duen orriak azure B-k eta eosinak zer egiten duten jasotzen du, baita bikoteak zergatik sortzen duen bakoitzak bere kabuz sortzen ez duen kolorea ere. Mikroskopiari eta laborategiko aplikazioei buruzko orriak alderdi praktikoa lantzen du: prestakin jakin batek zer erakusten duen, eta produktu jakin bat erabili nahi duzun metodorako egokia den nola ebaluatu.

Oraindik gaurkotasuna duen historiaren zatia

Kontakizun honetako xehetasun batek ez zion egia izateari utzi 1902an. Berrogeita hamar urte inguruz, munduko malaria-tindaketa estandarraren osagairik garrantzitsuena izenik gabeko ezpurutasun bat izan zen. Ustekabean zegoen han, kantitatea botila batetik bestera aldatzen zen, haren identitatea sekretu komertziala izan zen denbora horren zati batean, eta proportzioa eztabaidatu zen 1940ko hamarkadara arte. Tindaketa erabiltzen zutenak ez ziren arduragabeak. Ez zuten botilan zer zegoen jakiteko modurik.

Arazo beraren gaur egungo bertsioa materialaren zati bat bakarrik deskribatzen duen zehaztapen bat da. USP estandarra betetzea merkatuak eskaintzen duen purutasunik handiena lortzeko bidea da, argitaratutako estandar oso bat delako, eta ez neurketa bakar bat: identitatea, purutasuna, ezpurutasun organikoak —azur tindagaiak barne—, hondar-disolbatzaileak, ezpurutasun elementalak, errekuntza-hondarra, muga mikrobiarrak eta endotoxina bakterianoak. Blupremek farmazia-fabrikatzaile batengandik eskuratzen du bere metileno-urdina eta analisi-ziurtagiri osoa argitaratzen du, zerrenda horretako lerro bakoitza egiaztatu ahal izan dadin, baieztapen hutsa izan beharrean. Metal astunen emaitza bat jakinarazi eta horri USP betetzea deitzen dion ziurtagiria «metileno-urdin heldua» etiketa duen botila baten gaur egungo baliokidea da: agian erreaktibo ona da, baina etiketak ez dizu esaten zer dagoen barruan.