Metileno urdinaren mikrobioen eta onddoen aurkako ikerketa: argia eta iluntasuna

Bi irakurlek metileno urdinaren mikrobioen aurkako jarduera esamoldea ikusi, eta gauza desberdinak irudikatzen dituzte. Batak kontaktuan mikrobioak pozoitzen dituen likido urdin bat irudikatzen du. Besteak, tindagaiak eta argi gorriak batera mikrobioak suntsitzen dituzten prozedura bat. Bi irudiek dute egiaren zati bat. Bietako bat ere ez da kontzeptu osoa, eta horiek nahastean okertzen dira Interneteko baieztapen gehienak.

Bereizketa hori da berrikuspen honen gaia. Metileno urdinak toxikotasun apala du iluntasunean, kontzentrazioa nahikoa bada. Argi gorriarekin fotosentsibilizatzaile bihurtzen da: fotoi bat xurgatzen du, triplete-egoera erreaktibo batera iristen da, eta aldi berean itu askori kalte egiten dien kimika oxidatiboa eragiten du. Argi bidez aktibatutako jardun horrek bere izena du, mikrobioen aurkako terapia fotodinamikoa, eta bere baldintzak. Kontzentrazioak bakarrik ez du definitzen. Uhin-luzerak, argi-dosiak, inkubazioak, oxigenoak eta organismoak erabakitzen dute emaitza.

Hiltzeko bi kontzeptuak

Pentsatu lehenik iluntasuneko kontzeptuan. Metileno urdina karga positiboa duen fenotiazinio-tindagai bat da. Mikrobioen estalkiekin elkartzen da, zelulen barrura sartzen da neurri desberdinetan, eta erredox-erreakzioetan eta lotura kimikoetan parte hartzen du. Ez dago fotoirik tartean. Mikrobioak hiltzen dira, baina organismoaren arabera asko aldatzen diren kontzentrazioetan bakarrik, eta mekanismoak ez du itu bakar eta zehatz bat.

Kontzeptu fotodinamikoak argia gehitzen du. 630 eta 680 nm inguruko fotoi gorriak tindagaiaren xurgapen-bandarekin gainjartzen dira; monomeroaren gailurra 664 nm inguruan dago. Xurgapenak tindagaia iraupen laburreko singlete-egoera batera eramaten du, eta gero iraupen luzeagoko triplete-egoera batera. Hortik bi erreakzio-familia sortzen dira. I motako kimikan, tripleteak elektroi bat transferitzen dio substratu bati, eta superoxido- eta hidroxilo-espezieak barne hartzen dituzten bide erradikalarioak abiarazten ditu. II motako kimikan, energia zuzenean transferitzen dio oinarrizko egoeran dagoen oxigenoari, eta oxigeno singletea sortzen du. Biak aldi berean gerta daitezke, eta tindagaia oxigeno singlete hutseko agente gisa deskribatzea sinpleegia da. Fenotiazinio-fotosentsibilizatzaileen egitura-jarduera erlazioaren berrikuspen batek zuzenean erakusten du hori: antzeko tindagaien artean, bakterioen aurkako fototoxikotasuna ez zegoen oxigeno singletearen errendimenduaren menpe soilik, xurgapenak, kokapenak eta leuko forma inaktiborako erredukzioak fotofisikak bezainbesteko garrantzia zutelako. Uhin-luzeraren arauaren atzean dagoen fotokimika tindagaiaren eta argi gorriaren inguruko berrikuspen osagarrian azaltzen da.

Oxigeno singletea funtsezkoa da propietate erabilgarri baterako. Biomolekula askorekin erreakzionatzen du aldi berean; beraz, erasoa multifaktoriala da, entzima edo lotura-proteina bakar batera zuzendu beharrean. Mikrobioen aurkako kimioterapia fotodinamikoaren oinarrizko deskribapen batek horretan kokatu zuen ohiko erresistentzia-profilek pisu txikia izatearen arrazoia: penizilina lotzen duen proteina gehigarri batek edo topoisomerasa mutatu batek ez du oxigeno erreaktiboaren olde bat geldiarazten. Logika hori bete zen metizilinarekiko erresistentea den Staphylococcus aureus eta bankomizinarekiko erresistenteak diren enterokokoen aurkako probetan, beheko matrizeak erakusten duen bezala. Horrek ez du esan nahi erresistentzia ezinezkoa denik, beste modu batean funtzionatzen duela baizik. Kanporatze-ponpek eta defentsa antioxidatzaileek oraindik ere behar den dosia alda dezakete, bereziki onddoetan.

Organismoen eta azterketa-ereduen matrizea

Taula hau da artikuluaren funtsezko osagaia. Balio bakoitza protokolo jakin bati dagokio: tindagai bera, baina argi-dosi edo inkubazio desberdina, eta beste zenbaki bat. Ez hartu MBC, MLC eta MIC baliokidetzat. Hemen, MBC eta MLC balioek esan nahi dute azpikultiboan ez dela bizirik geratutakorik agertzen; MIC balioak, berriz, hazkundearen inhibizioa adierazten du. Sarrera bakoitzarekin argiztapen-baldintzak ematen dira.

Organismoa eta eredua	Emaitza iluntasunean	Emaitza argiarekin	Baldintzak
S. aureus NCTC 6571, esekidura planktonikoa	MBC 5 uM	MBC 5 uM	Berrikuspeneko taula, argi zuria 12 J per cm2
S. aureus NCTC 6571, esekidura planktonikoa	MLC 2.5 uM	MLC 1 uM	1997ko jatorrizko protokoloa, 1.7 mW per cm2 ordubetez, 6.3 J per cm2 inguru, inokulua 10^6 CFU per mL ingurukoa, fenotiazinioen jarduera fotobakterizidaren jatorrizko azterketan jasoa
MRSA EMRSA-15, planktonikoa	MBC 80 uM	MBC 20 uM	Berrikuspeneko taula, 12 J per cm2 inguru, sentsibilizazioa lau aldiz handiagoa
MRSA EMRSA-16, planktonikoa	MBC 40 uM	MBC 10 uM	Aurreko protokolo bera
E. coli NCTC 9001, planktonikoa	MBC 500 uM	MBC 100 uM	Protokolo bera, sentsibilizazioa bost aldiz handiagoa
P. aeruginosa NCTC 10622, planktonikoa	MBC 500 uM	MBC 25 uM	Protokolo bera, sentsibilizazioa hogei aldiz handiagoa
E. faecalis NCTC 775, planktonikoa	MLC 100 uM	MLC 100 uM	1997ko protokoloa 6.3 J per cm2 erabiliz, hobekuntzarik ez andui eta dosi horretarako
Bankomizinarekiko erresistentea den E. faecium, planktonikoa	MBC 400 uM	MBC 400 uM	Berrikuspeneko taula, hobekuntzarik ez jatorrizko tindagaiarekin; deribatu metilatu hidrofoboagoek, ordea, hobekuntza erakutsi zuten, bankomizinarekiko erresistenteak diren enterokokoen azterketaren arabera
Candida albicans, planktonikoa	MIC 12.79 ug per mL baino handiagoa	MIC 12.79, 6.39 eta 1.59 ug per mL, hurrenez hurren 5, 10 eta 15 J per cm2 erabiliz	30 minutuko aurreinkubazioa iluntasunean, 600 eta 650 nm arteko LED gorria, gailurra 635 nm-an, metileno urdinaren onddoen aurkako jarduera fotodinamikoaren dosi-erantzun azterketa baten arabera
C. albicans YEM14 eta kanporatze-ponpak gainadierazten dituen aldaera, CFU bidez neurtutako hilketa	Ez dagokio	Jatorrizko anduian 5 log inguruko hilketa; CDR1/CDR2 gainadierazten duen aldaeran, ia hilketarik ez	100 uM tindagai, 30 minutuko inkubazioa, 660 nm eta 60 J per cm2, kanporatze-ponpek metileno urdinaren fotohilketan duten eraginaren azterketa baten arabera
Trichophyton rubrum hifak eta esporak	Ez dagokio	Hifen MIC 6.3 ug per mL ingurukoa, esporena 2.0 ug per mL ingurukoa; CFUren erabateko blokeoak hifetan 5 ug per mL eta 100 J per cm2 behar izan zituen, eta esporetan 1.25 ug per mL eta 40 J per cm2	635 nm-ko protokolo fotodinamikoa, dermatofitoen garapen-fasearen araberako sentikortasunaren azterketa baten arabera
33 espezieko biofilm subgingibal heldua, Calgary gailua, 6. eguna	MB bakarrik: kopuru osoa ehuneko 80 baino gehiago jaitsi zen	MB eta 660 nm-ko LEDa: jarduera metabolikoa ehuneko 55 inguru jaitsi zen, komunitatearen berregituraketa zabalik gabe	Ehuneko 0.01eko tindagaia (100 ug per mL), 660 nm eta 330 mW per cm2 inguru 5 minutuz, hazkunde anaerobioa, espezie anitzeko ahoko biofilmaren in vitro azterketa baten arabera

Hiru joera nabarmentzen dira. Lehenik, estafilokoko Gram-positiboak maila mikromolar baxuetan hiltzen dira; bazilo Gram-negatiboek, berriz, iluntasunean ehun aldiz tindagai gehiago behar dute gutxi gorabehera, Gram-negatiboen kanpo-mintzak sarrera mugatzen duelako. Argiak aldea txikitzen du, baina ez du desagerrarazten. Bigarrenik, metileno urdinaren onddoen aurkako jarduera benetakoa da, baina baldintzen menpekoa: metileno urdinak Candida hiltzeko duen gaitasuna nabarmen handitzen da argi-dosiarekin, eta fenotipo-aldaketa bakar batek, hala nola kanporatze-ponpen gainadierazpenak, 5 log-eko hilketa ezaba dezake dosi bera erabilita. Hirugarrenik, biofilm helduak ez du esekidurek bezala jokatzen; testuinguru horretan ulertu behar da ahoko biofilmaren errenkada.

Bakterioak: non laguntzen duen argiak gehien, eta non ez

Estafilokokoak dira kasu sentikorra. MRSA epidemikoaren berrikuspen-taulako balioak ere bankomizinaren konparazio-balioaren parean edo azpitik daude argia aplikatzen denean, eta deribatu dimetilatuek emaitza are hobeak eman zituzten, metilazioak lipofilikotasuna eta oxigeno singletearen errendimendua handitu zituelako, leuko formarako erredukzioari aurre egitearekin batera. Xehetasun kimiko horrek garrantzia du: erakusten du hilketa tindagaia bere tokira iristearen eta fotofisikaren emaitza dela, ez fotofisikarena bakarrik.

Organismo Gram-negatiboek tindagaiaren iristearen alderdia erakusten dute. Pseudomonas-ek 500 uM behar izan zituen iluntasunean eta 25 uM argiarekin, hogei aldizko hobekuntza; hala ere, argiztatutako balioa estafilokokoen tartea baino askoz handiagoa da oraindik. Karga kationikoak tindagaia kanpo-mintzera hurbiltzen laguntzen du, baina barneratzea da oraindik muga. Formulazioek, inkubazio-denborak eta deribatuaren aukeraketak zenbaki horiek gehiago aldatzen dituzte tindagai bera dosi handiagoan berriro erabiltzeak baino.

Enterokokoek zuhurtzia eskatzen dute. Protokolo zaharragoetan, E. faecalis-ek ez zuen argiarekin inolako abantailarik erakutsi, eta bankomizinarekiko erresistentea den E. faecium-ek beste molekula bat behar izan zuen, ez argi gehiago. Metileno urdinaren MBC bakar bat bakterioen aurkako konstante orokor gisa aipatzen duenak oker interpretatzen du literatura. Ez dago halako konstanterik. Andui, hazkuntza-ingurune, inokulu, inkubazio, uhin-luzera eta fluentzia jakinei dagozkien balioak baino ez daude. Hilketa-kurbak interpretatzeko gidak azaltzen du balio horiek nola irakurri norberaren burua engainatu gabe.

Onddoak: sentikorrak, baina faseak eta ponpek erabakitzen dute

Glukanoz, mananoz eta kitinaz osatutako onddoen hormek bakterioetan ez bezalako xurgapen-arazoa sortzen dute, eta onddoek defentsa aktiboak ere badituzte. Goiko Candida-ren kanporatze-emaitza da adibiderik argiena: tindagai bera, argi bera eta ingurune bera erabilita, gainadierazpena zuen aldaerak bizirik iraun zuen, baina jatorrizko anduiak koloniak eratzeko unitateen ehuneko 99.999 inguru galdu zuen. Dermatofitoek garapenaren alderdia gehitzen dute. Esporak hifak baino askoz errazago hiltzen dira; beraz, esporak ezabatzen dituen protokolo batek hifa-zati bideragarriak utz ditzake dosi berarekin.

Horregatik, metileno urdinaren onddoen aurkako txostenek bakterioen txostenek bezainbesteko zorroztasuna behar dute argiztapenari dagokionez. Azazkalen eta larruazalaren azterketa fotodinamiko klinikoetan, ehuneko 1 eta 2 arteko tindagaia argi gorri neurtuarekin konbinatu zen, fluentzia zehaztuetan eta jarraipenarekin, eta itxura klinikoa eta ezabatze mikologikoa bereizi ziren. Saiakuntza horiek azazkaletako eta larruazaleko onddoei buruzko ebidentzia fotodinamikoaren laburpenean berrikusten dira. Lesio batean tindagai diluitua gelako argitan ukituka jartzeak kolorea erreproduzitzen du, baina prozedura alde batera uzten du.

Biofilmaren egiaztapena: 33 espezieko ahoko eredua

2024ko espezie anitzeko ahoko biofilmaren azterketak arreta merezi du, kasu zaila aztertzen duelako, erraza beharrean. Ahoko hogeita hamahiru espezie, besteak beste Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Fusobacterium eta ahoko estreptokokoak, baldintza anaerobioetan hazi ziren, 6. egunerako biofilm heldua osatuz. Tratamendua ehuneko 0.01eko tindagaia eta 660 nm-ko LEDa izan zen, 5 minutuz, irradiantzia handiarekin. Bai tindagaiak bakarrik, bai argiak bakarrik, nabarmen murriztu zituzten kopuru osoak, eta konbinazioak jarduera metabolikoa erdira jaitsi zuen gutxi gorabehera; hala ere, komunitatea ez zen berregituratu eta biofilma ez zen esterilizatu.

Benetako efektua da hori, muga argi batekin. Garbitutako poltsa batean tratamendu fotodinamikoa tokiko osagarri gisa erabiltzea babesten du, ez diagnostikatutako periodontitisa bere kabuz tratatzen duen aho-garbigarri gisa. Horrek hutsune orokorrera garamatza.

Zergatik laborategiko hilketa ez den tratamenduaren baliokidea

MBC planktoniko baten proban, zelula uniformeei tindagai uniformea eta argi uniformea aplikatzen zaizkie ingurune oxigenatuan. Lesio batek ez du horrelakorik eskaintzen. Matrizeak sarrera moteltzen du, egoera iraunkorren antzekoek oxidazioa jasaten dute, odolak eta exudatuak argia xurgatzen dute, ehunen geometriak itzalak sortzen ditu, eta poltsa hipoxikoek II motako kimika ahultzen dute, oxigeno singleteak definizioz oxigeno molekularra behar duelako. Infekzio mistoek xurgapen eta sentikortasun desberdineko espezieak gehitzen dituzte; beraz, erreferentziako andui bakar baten balioak ezin du gune osoa ordezkatu.

Ahoko adibideak hutsune hori zehazten du. Plaka batean Porphyromonas edo estreptokokoak murrizteak, edo kultibatutako biofilm bat erdira murrizteak, ez du frogatzen aho-garbigarri urdin batek periodontitisa tratatzen duenik, infekzio endodontiko bat sendatzen duenik edo bakteriemia ezabatzen duenik. Arreta periodontal klinikoa biofilma mekanikoki haustearen eta kentzearen menpe dago, poltsaren anatomiaren kudeaketarekin batera; argian oinarritutako tratamendua tokiko osagarri gisa aztertzen da. Laborategiko putzu batean hiltzen duen tindagai-kontzentrazioak ez du erlazio finkorik hortzoiaren azpiko bakterioetara iristen den kontzentrazioarekin, eta gelako argia ez da 660 nm-ko dosi bat. Ahoko edozein erabileraren dosiak, segurtasuna eta interakzioen mugak klinikari batekin aztertu behar dira, segurtasunari eta interakzioei buruzko erreferentzian azaltzen den bezala.

Zer ez den ebidentzia hau

Ez da etxeko desinfektatzaile bati buruzko baieztapena. Taula bakterizidek andui, hazkuntza-ingurune, kontaktu-denbora, espektro eta fluentzia zehaztuak erabiltzen dituzte. Ez dute ezer esaten sukaldeko gainazalei, zikinkeria organikoan behar diren kontaktu-denborei edo arauzko desinfekzio-estandarrei buruz.

Ez da antibiotiko sistemikoen ordezko bat ere. Ohiko jarduera fotodinamikoak tindagaia, xurgatutako argia eta oxigenoa behar ditu toki berean eta aldi berean. Argia ez da gune sakon edo barreiatuetara iristen, irentsitako botika bat odolera iristen den moduan. Literaturak tokiko infekzio irisgarrietarako edo osagarri gisa kokatzen du ikuspegi hau, Wainwright-ek hasieratik tokiko desinfekzioa planteatu zuen bezala.

Laburpen zuzena estuagoa da, eta hala ere interesgarria. Metileno urdinak mikrobioen aurkako jarduera apala du iluntasunean, eta argi gorriak askoz efektu fotodinamiko handiagoa eragiten du bakterio eta onddo askotan. Argiaren eta iluntasunaren arteko aldeak handiak izan daitezke: Pseudomonas-en kasuan 500 uM-tik 25 uM-ra, eta MRSA epidemikoan 80 uM-tik 20 uM-ra; aldi berean, porrot argigarriak ageri dira enterokokoetan eta kanporatze-gaitasuna duen Candida-n. Laborategitik aplikaziora igarotzea tindagaia bere tokira iristearen, biofilmaren fisiologiaren eta oxigenoaren menpe dago, tindagaiaren kontzentrazio nominalaren menpe bezainbeste. Baldintza horiek agerian mantenduz gero, zenbakiek esanahia dute. Horiek kenduta, ez dute ezer esan nahi.