Metileno urdinaren kalibrazio-kurba eraikitzea: lagin zuriak, tartea eta linealtasuna

Bi analistak metileno urdinaren oinarrizko disoluzioaren botila bera erabiltzen dute, eta bakoitzak kalibrazio-kurba bat eraikitzen du. Lehenak jatorritik igarotzen den lerro zuzena lortzen du, eta konfiantzaz neurtzen ditu lagin ezezagunak. Bigarrenak goiko muturrean okertzen den lerroa lortzen du, zerora hurbiltzen ez den ordenatu-jatorria eta diluzioarekin aldatzen diren lagin-emaitzak. Koloratzaile bera, tresna bera, uhin-luzera bera. Aldea ez dago trebetasunean. Diseinuan dago: lagin zurian zer sartu den, zer kontzentrazio aukeratu diren eta egiaztatutako tartea eredu sinple bakar batek oraindik balio duen eremuan mantendu den.

Kalibrazio-kurba tresna baten erantzunaren eta kontzentrazio baten arteko kontratua da, eta eraiki zen baldintzetan bakarrik da balioduna. Metileno urdinaren kasuan, kontratu horrek ahulgune ezagun bat du. Koloratzailea bere buruarekin elkartzen da uretan; beraz, argia xurgatzen duen espeziea kontzentrazioaren arabera aldatzen da. Aldaketa hori zeharkatzen duen kurba ez da zuzena izango, eta estatistikak, zenbat erabili ere, ez du hori konponduko. Artikulu honek lerroak zentzua izan dezan kurba nola diseinatu azaltzen du: aukeratu lagin zuri egokia, mantendu tartea monomeroa nagusi den eremuan, egin benetako erreplikak eta interpretatu kurbadura informazio gisa, ez zarata gisa.

Hasi lagin zuriarekin, ez estandarrekin

Lagin zuriak zeroa definitzen du, eta metileno urdinaren kasuan dena eduki behar du, koloratzailea izan ezik. Uraren kalitate-maila bera, tanpoi eta pH bera, gatz berak, kodisolbatzailearen frakzio bera eta tenperatura bera. Prestatu kalibrazio-estandarrak matrize berdin horretan. Arrazoia kimikoa da, ez burokratikoa. Gatzak eta disolbatzaileak monomeroaren, dimeroaren eta agregatu handiagoen arteko oreka aldatzen dute, eta horrek neurketa-uhin-luzerako espektroa aldatzen du. Urez bakarrik osatutako lagin zuri batek ezin du matrizeak espeziazioan eragindako aldaketa zuzendu. Metileno urdinaren uretako espektroen analisi globalak, sarbide irekiko erregistroaren bidez eskuragarri dagoenak, sodio kloruroaren kontzentrazioa 0 eta 0.15 M artean aldatu zuen, hain zuzen ere indar ionikoak oreka aldatzen duelako; agregazioa handitu egin zen gatzarekin.

Ondorio praktiko bat: ez kalibratu inoiz ur desionizatuan eta gero laginak fosfato-tanpoian edo hondakin-uren iragazkinean neurtu. Analitorik gabeko matrizerik ez dagoenean, laginari berari estandarra gehitzea hobea da matrizearekin bat ez datorren kanpoko kurba erabiltzea baino. Uretako saiakuntzen fidagarritasuna mantentzeko jarraibideak matrizeei eta interferentziei buruzko azalpenean daude, eta koloratzaileen saiakuntza kuantitatiboen printzipio orokorrak saiakuntzen diseinuari buruzko ikuspegi orokorrean azaltzen dira.

Aukeratu espezie bakarra nagusi den tartea

664 nm inguruko uhin-luzera luzeko bandan kuantifikatzeak koloratzaile gehiena monomero gisa dagoela suposatzen du. Ur hutsean, suposizio horrek disoluzioak diluituta dauden bitartean bakarrik balio du, gutxi gorabehera kontzentrazio mikromolar baxuen eremuan. Argitaratutako malda enpirikoek muga hori erakusten dute: 1 cm-ko kubetetan 7 mikromolar ingurutik behera mantendutako kalibrazioek 82,000 M-1 cm-1 inguruko malda ematen dute; 37 mikromolar ingururaino zabaldutako kalibrazioan, berriz, malda 67,100 ingurura jaisten da, kontzentrazio handieneko estandarrek dagoeneko dimero kantitate esanguratsua dutelako. Hemen aipatutako koefiziente bakoitzaren baldintzak metileno urdinaren erreferentzia espektralean adierazita daude; hori da zenbakiak alderatzeko leku egokia. Artikulu honek tartea ezartzeko bakarrik erabiltzen ditu.

Hortik zuzenean ondorioztatzen dira diseinu-arauak:

1. Mantendu kontzentrazio handieneko estandarra behar bezain diluituta, espektroaren forma egonkorra izan dadin. Garapen-fasean, eskaneatu ikusgaiaren tarte osoa (550 eta 750 nm artean, gutxi gorabehera) maila bakoitzerako, uhin-luzera bakarra irakurri beharrean. Espektro normalizatuen forma kontzentrazioarekin aldatzen bada, kimika aldatzen ari da eta tartea zabalegia da.
2. Jarraitu 610 nm inguruko absorbantziaren eta 665 nm inguruko absorbantziaren arteko erlazioa maila guztietan. Kontzentrazioarekin handitzen den erlazioak adierazten du dimeroaren sorbalda handitzen ari dela eta monomeroaren ereduak huts egiten duela. Diagnostiko hori xehetasun handiagoz azaltzen da agregazioaren eta kontzentrazioaren eraginei buruzko gidan.
3. Erabili 1 cm-ko kubeta kontzentrazio mikromolar baxuetan lan egiteko. 82,000 inguruko maldarekin, 5 mikromolarrek 0.41 inguruko absorbantzia ematen du, eta 10 mikromolarrek 0.82 ingurukoa; biak ere erosoak dira tresna gehienentzat.
4. Oinarrizko disoluzio kontzentratuetarako, laburtu bide optikoa 1 baino askoz handiagoa den absorbantzia onartu beharrean, baina gogoratu bide laburrak fotometria zuzentzen duela, ez kimika. Agregazioa kontzentrazioaren araberakoa da, ez bide optikoaren luzeraren araberakoa; beraz, oinarrizko disoluzio kontzentratu batek espeziazioa kontuan hartzen duen tratamendu propioa behar du oraindik, monomero diluituaren kurba erabili beharrean.

Irudi honen zati handi baten oinarrian dagoen doikuntza globalak 224 espektro hartu zituen, 1.1 mikromolarretik 3.4 milimolarrera, eta tetrameroaren seinalea jada 34 mikromolarretik behera hauteman zitekeela aurkitu zuen. Aurkikuntza horrek ikuspegia ezartzen du: leiho lineala intuizioak iradokitzen duena baino estuagoa da; beraz, egiaztatu, ontzat eman beharrean.

Mailak, erreplikak eta ordena

Hiru puntuko kurba batek ez du ezer frogatzen. ICH Q2(R2) baliozkotze-jarraibideek gutxienez bost kontzentrazio eskatzen dituzte linealtasuna ebaluatzeko, eta zero ez diren sei edo zortzi mailak lan-kurba sinesgarriagoa ematen dute, bereziki agregazioa hasten den goiko muturretik gertu. Banatu mailak aurreikusitako lagin-tartea estaltzeko, kurbadura agertzeko probabilitate handiena dagoen tokietan dentsitate handiagoa emanez, erosotasunagatik aukeratutako serie geometriko bat erabili beharrean.

Neurtu maila bakoitza bi edo hiru erreplikatan, bakoitza modu independentean prestatuta, matraze beretik hiru irakurketa egin beharrean. Erreplika independenteek prestaketa-errorea agerian uzten dute; matraze bereko irakurketa errepikatuek tresnaren zarata bakarrik erakusten dute. 2020ko azterketa globalak disoluzio bakoitza hiru aldiz neurtu zuen, eta hori oraindik ere aukera lehenetsi egokia da. Ausazkotu irakurketa-ordena, deriba, beirarekiko adsortzioa edo tenperatura-aldaketa kurbadurarekin nahas ez daitezen. Kuartzozko kubetei buruzko azterketa batek aurkitu zuen 34 mikromolarreko disoluzio bateko koloratzailearen ehuneko 3 inguru adsorbatu zela 10 minuturen barruan; beraz, mantendu kontaktu-denbora, kubeta, garbiketa eta sekuentzia berdin neurketa-saio osoan.

Adibide ebatzia, azalpenetarako (ez dira neurtutako datuak)

Beheko zenbakiak asmatuak dira, kalkuluak erakusteko. Ez dira laborategiko neurketak, eta ez dira metileno urdinaren datu gisa aipatu behar. Garrantzitsuena haien inguruko egiaztapenen eredua da.

Demagun sei estandar daudela bat datorren tanpoian, 1 cm-ko bide optikoarekin, 665 nm-an irakurrita dagokien lagin zuriaren aurka:

Batez besteko absorbantzia kontzentrazioaren arabera lerro zuzen batera doitzeak mikromolar bakoitzeko 0.0805 absorbantzia-unitate inguruko malda ematen du, eta zerotik miliabsorbantzia-unitate gutxi batzuetara dagoen ordenatu-jatorria. Malda bide optikoaren luzeraz zatituz, itxurazko xurgakortasuna lortzen da: mikromolar bakoitzeko 0.0805 balioa 80,500 M-1 cm-1 ingururen baliokidea da, uretan monomeroa nagusi den tartearekin bat datorrena. Egiaztapen garrantzitsua ez da R karratua, bikaina irudituko baita edonola ere. Garrantzitsuak dira zerotik hurbil dagoen ordenatu-jatorria, S2tik S5era konstante mantentzen den A610/A665 erlazioa eta joerarik gabe sakabanatutako hondarrak. S6ko erlazioaren igoera seinale argia da maila hori baztertzeko edo 7 mikromolar matrize eta tresna konbinazio horren behin-behineko goiko muga gisa markatzeko.

Baldintza berdinetan 0.245eko irakurketa ematen duen lagin ezezagun bat zuzenean bihurtzen da: 0.245 mikromolar bakoitzeko 0.0805 balioaz zatituz, 3.0 mikromolar inguru lortzen da, laginaren edozein diluzio-faktore aplikatu aurretik. Eman emaitza haren baldintzekin batera: uhin-luzera, bide optikoa, lagin zuriaren matrizea, kalibrazio-tartea eta data.

Betetzeko kalibrazio-lan-orria

Kopiatu txantiloi hau laborategiko erregistroan matrize berri bakoitzerako. Matrize bat, orri bat, kurba bat.

Erreaktiboaren formari dagokion errenkadak badu bere arrazoia. Metileno urdin komertziala gatz anhidroa edo hidrato bat izan daiteke, hala nola trihidratoa, eta masa molar okerrak kontzentrazio nominal guztiak desbideratzen ditu, oharkabean. Abiapuntuko materialaren purutasunaren eta espezifikazioen egiaztapenak kalitateari eta kalitate-mailei buruzko gidan azaltzen dira.

Egiaztatu kontrol-estandar independente batekin

Kalibrazio-kurba batek ez luke inoiz bere burua ebaluatu behar. Doikuntza egin ondoren, prestatu kontrol-estandar bat bereiz pisatutako oinarrizko disoluzio batetik, onartutako tartearen erdialdetik hurbil dagoen kontzentrazioan, eta irakurri lagin ezezagun gisa. Ehuneko gutxi batzuen barruko adostasunak prestaketa-katea berresten du; desadostasunak oinarrizko disoluzioa edo diluzioak jartzen ditu zalantzan, tresna baino gehiago. Errepikatu kontrol-estandarra lagin-sorta bakoitzarekin. Haren emaitza desbideratzen bada kurba aldatu gabe dagoen bitartean, jarri zalantzan lan-disoluzioak edo kubeta, laginak baino lehen. Ohitura bakar honek oharkabean gertatzen diren errore gehienak hautematen ditu: hidratoaren masa molarra botila anhidro bati aplikatzea, kalibraziotik kanpo dagoen mikropipeta bat edo indar ioniko okerrarekin prestatutako tanpoi bat. Erregistratu kontrol-estandarraren berreskurapena lan-orrian, maldaren ondoan, geroagoko irakurleak ikus dezan lerroa probatu egin zela, ez soilik marraztu.

Ez-linealtasuna diagnostiko gisa interpretatzea

Kurba okertzen denean, desbideratzearen formak kausa identifikatzen du. Absorbantzia handietan beherantz okertzeak, espektroaren forma aldatu gabe, tresnara zuzentzen du arreta; askotan, argi parasitoak absorbantzia handiak txikiagoak diruditen balioetara desbideratzen ditu. Kurbadurarekin batera 610 nm-ko sorbalda handitzen bada, kimikara zuzentzen du arreta: dimeroak eta agregatu handiagoek monomeroak ez bezala xurgatzen dute. Zerora doitzen ez den lagin zuri batek edo denborarekin jaisten diren estandarrek ontzira zuzentzen dute arreta: beirarekiko edo kubetekiko adsortzioa, bereziki kontaktu-denborak neurketa-saioan zehar aldatu badira. Eta puntuetan zehar garbi igarotzen den lerro batek laginen emaitza okerrak ematen baditu oraindik, matrizera zuzentzen du arreta: laginak kalibrazio-estandarretatik desberdinak dira; beraz, berreraiki kurba laginaren matrizean edo erabili estandarraren gehikuntza. Kasu guztietan, irudikatu hondarrak kontzentrazioaren arabera. Ausazko sakabanaketak lerro zuzenaren eredua babesten du; irribarre- edo kopetilun-formako kurbadurak, berriz, edozein R karratuko atalasek baino fidagarriago gezurtatzen du. Baliozkotze-jarraibideek esplizituki berresten dute hori.

Metileno urdinarekin, diziplina horrek merezi du. Monomeroaren banda sendoa da, haren kimika ondo aztertuta dago, eta hutsegite-moduek espektroan ematen dute beren berri zenbakiak hondatu aurretik. Eraiki kurba tarte estuan, erabili dagokion lagin zuria, egin erreplikak modu independentean eta utzi espektroen formari tartea erabakitzen. Lortutako lerroa laburra da, baina haren puntu guztiak egiazkoak dira.

Artikulu honetako azalpen-kalkuluek zenbaki asmatuak erabiltzen dituzte metodoa erakusteko. Neurtutako erreferentzia-koefizienteak, baldintza guztiekin batera, estekatutako erreferentzia espektralean agertzen dira, eta oinarrian dagoen agregazio-azterketa PMID 33251415 erregistroan indexatuta dago.