Legamiaren saiakuntzak metileno urdinarekin: zelula biziak zenbatzea eta arnasketa kronometratzea

Bi hodi daude laborategiko mahaian. Biak urdinak dira. Batean, mikroskopioan ikusten diren zelula urdinek legamia hilda dagoela adierazten dute. Bestean, urdinetik koloregabera aldatzen den hodiak legamia bizirik dagoela eta arnasten ari dela adierazten du. Koloratzaile bera, kontrako interpretazioak. Bi saiakuntzak nahastuz gero, ondorio guztiak alderantzikatzen dira.

Bereizketa hori da artikuluaren ardatza. Metileno urdina erredox koloratzaile bat da: oxidatuta urdina da; erreduzituta, leukometileno urdin koloregabea. Bideragarritasun-zenbaketak kimika hori baliatzen du behaketa mikroskopiko labur batean. Arnasketa-esperimentuak, berriz, lagin osoaren erreakzio kronometratu batean baliatzen du. Bakoitzak bere protokoloa, bere kontrolak eta bere eszeptizismoa behar ditu.

Bideragarritasun-zenbaketa: tindaketa laburra, berehala aztertua

Garagardogintzako protokoloa da bertsiorik estandarizatuena. Prestatu 0.01% w/v metileno urdin 2% sodio zitratoan, nahastu 1:1 proportzioan legamia-esekidurarekin, eta aztertu nahastea tarte labur eta finko baten ondoren. Argitaratutako tarteak aldatu egiten dira: 1 eta 2 minutu artean Brewing Science Institute erakundearen eskuliburuan, eta 5 minutu inguru ikerketa-protokoloetan; OIV erakundearen ardo-mikrobiologiako metodoak, berriz, azterketa 10 minuturen barruan egitea eskatzen du. Zenbaketa-nahastean koloratzailearen kontzentrazioa 0.005% ingurukoa izaten da. Kargatu Neubauer ganbera hobetu bat, eta 400x inguruko handipenarekin sailkatu zelula urdin ilunak bideraezin gisa eta tindatu gabeko zelulak bideragarri gisa. OIV metodoan zelula urdin argiak bizitzat zenbatzen dira; horrek jada iradokitzen du behean aztertzen den subjektibotasun-arazoa.

Zelula-kontzentrazioa ganberaren geometriatik ateratzen da. Erdiko 1 mm-ko karratu osoa zenbatzen denean, mL bakoitzeko zelula kopurua N bider diluzio-faktorea bider 10^4 da; N eremu horretako zenbaketa da, ASBC erakundearen legamia-metodoetan azaltzen den bezala. Bideragarritasuna sinpleagoa da: tindatu gabeko zelulak zati zelula guztiak, bider 100. Zenbatu 400 zelula inguru bideragarritasuna estimatzeko, FEMS aldizkariko garagardogintzako konparazio-azterketari eta OIV jardunbideari jarraituz. Erabili ertzetako zelulak zenbatzeko arau bera beti; adibidez, sartu beheko eta ezkerreko sareta-lerroetako zelulak, eta baztertu goiko eta eskuinekoetakoak.

Kimuetarako arau bat behar da zenbatzen hasi aurretik. Ohiko irizpide batek kimua zelula bereizi gisa zenbatzen du zelula amaren tamainaren erdira gutxi gorabehera iristen denean; tamaina horretatik behera, amarekin batera zenbatzen du. Aukeratzen den araua edozein dela ere, aplikatu karratu guztietan eta idatzi lan-orrian, hurrengo pertsonak gauza bera egin dezan.

Zenbaketa-orria (inprimatu hau)

Lan-orri hau artikulu honetarako sortutako baliabide originala da. Kopiatu koaderno batean edo inprimatu bana lagin bakoitzeko.

Bideragarritasuna (%) = 100 x tindatu gabeak / (tindatu gabeak + urdin ilunak). mL bakoitzeko zelula guztiak = N x diluzio-faktorea x 10^4, N zehaztutako ganbera-eremutik hartuta. Idatzi tindaketa-tartea emaitzaren ondoan, denbora hori gabe bideragarritasun-balioa ezin baita erreproduzitu.

Zergatik aldatzen diren bideragarritasun-balioak

Denbora da lehen interferentzia, eta bi noranzkoetan eragiten du. Metabolikoki aktiboak diren zelulek koloratzailea erreduzitzen dute; beraz, goizegi aztertuz gero, zelula biziak erredukzioa amaitu aurretik ikus daitezke eta oker hil gisa sailkatu. Baina esposizio luzea bera toxikoa da eta benetan kaltetutako zelula urdinak sortzen ditu, tindaketak heriotza faltsuki adieraztea eraginez. Horregatik, laborategiko irakaskuntza-protokolo batek 5 minuturen barruan zenbatzea zehazten du, Wisconsingo legamiari buruzko irakaskuntza-protokolo batean dokumentatzen denez. Formulazio zuhurra da metileno urdinarekin egindako sailkapena denboraren mendekoa dela; hortaz, finkatu tarte labur bat eta mantendu berdin serie bateko lagin guztietan.

Bideragarritasun txikiko laginek bigarren alborapen bat dute. Metodo estandarizatuak ohartarazten du metileno urdinak benetako bideragarritasuna gehiegi estima dezakeela 80% ingurutik behera, oraindik koloratzailea erreduzitzen duten zelulek ez dutelako zertan ugaltzeko gaitasuna mantendu. Garagardogintzako literaturak fidagarritasun-falta bera deskribatzen du bideragarritasuna nabarmen hondatuta dagoenean. Erabili metileno urdina gutxi gorabeherako estimazio azkar gisa, eta berretsi bideragarritasun txikiarekin lotutako erabaki kritikoak, hala nola kultura bat berriro inokulatzeko erabiltzea, plaketako zenbaketen edo tindaketa osagarri baten bidez.

Matrize-efektuak dira hirugarrenak. OIV metodoa pH 4.6 inguruan egiten da, eta ohartarazten du pH baxuko eta indargetze-ahalmen handiko laginek koloratzaileak behar bezala jokatzea eragozten dutela; halaber, ez du saiakuntza gomendatzen azukre-kontzentrazioa 100 g/L-tik gorakoa denean, zelulek urdin argi engainagarria erakusten baitute. Tindaketaren pH-aren konparazio esperimental batek sentikortasunaren aldaketa nabarmenak aurkitu zituen aztertutako tartean, pH-aren mendeko metileno urdinaren metodoari buruzko azterketa batekin bat etorriz. Hondakinak beste tranpa bat dira: beratze-nahaste zikinetako partikula tindatuek zelula hilak dirudite eta operadoreen arteko aldakortasuna handitzen dute.

Aldakortasun hori kuantifikatuta dago, ez da anekdotikoa. FEMS aldizkariko legamiaren konparazioan argitaratutako sei hilabeteko garagardotegi-saiakuntza batean, metileno urdinarekin egindako neurketa bikoiztuen desbideratze estandarra batez beste 6.1% izan zen, oxonolarekin egindako fluxu-zitometriaren 0.2%-aren aldean; bi operadoreen emaitzek lagin berean 13 ehuneko-punturainoko aldea izan zuten. Bideragarritasun-metodoen 2023ko konparazio kuantitatibo batek fluoreszentzia-mikroskopia eta fluxu-zitometria askoz zehatzagoak zirela aurkitu zuen, eta, aldi berean, errendimendua espeziearen eta matrizearen mendekoa dela erakutsi zuen. Painting eta Kirsopen metodoaren deskribapen klasikoak (PMID 24430080) erreferentzia izaten jarraitzen du, eta legamiaren bideragarritasun- eta bizitasun-saiakuntzen berrikuspen zabalago batek (PMID 25154541) metileno urdina proba osagarrien artean kokatzen du, ez behin betikoen artean. Tripan urdina ez da hemen hobekuntza automatikoa: mintzaren osotasun-galera adierazten du; metileno urdinak, berriz, zelulan sartzea eta erredukzio-jarduera adierazten ditu. Horregatik, estrespeko zelulak desberdin sailka daitezke bi koloratzaileekin.

Arnasketa-esperimentua: kronometratu urdinaren desagerpena

Bigarren saiakuntzan ez da mikroskopiorik erabiltzen. Legamia, glukosa eta metileno urdin diluitua hodi itxi batean sartzen dira, eta kronometroak urdina desagertzeko behar den denbora neurtzen du. Zelulek metabolismoa gauzatzean, koloratzaile urdina forma koloregabera bihurtzen duten baliokide erreduzitzaileak sortzen dituzte; oxigeno disolbatuak, berriz, atzera oxidatzen du. Zelulek oxigenoa gutxitzen dutenean, erredukzio garbia nagusitzen da eta hodia koloregabetzen da. Beraz, amaiera-puntuak arnasketaren, koloratzaile-kontzentrazioaren eta oxigeno-eskuragarritasunaren arteko oreka islatzen du, eta metileno urdinaren erredukzio- edo koloregabetze-denbora gisa jakinarazi behar da, ez oxigeno molekularraren kontsumo-tasa zuzen gisa.

Erabili bideragarritasun-lanetan baino koloratzaile askoz diluituagoa, denbora neurketa-tarte eroso batean egon dadin. AQA erakundearen A level mailako nahitaezko praktiken eskuliburuak ondo estandarizatzen du hau: 1 g glukosa 30 C ingurura berotutako 100 mL uretan, 5 g legamia lehor erabili baino justu lehenago gehituta, eta 0.001% inguruko lan-koloratzailea, 1%-eko ama-disoluzio baten 0.1 mL 100 mL-ra diluituz prestatua. Nahastu legamia-glukosa esekiduraren 2 mL lan-koloratzailearen 2 mL-rekin, utzi saiakuntzaren tenperaturara iristen, astindu behin 10 segundoz, abiarazi kronometroa eta ez astindu berriro. Astintzeak oxigenoa berriro sartzen du eta hodia berriz urdintzen du; hori da prozeduraren artefaktu nagusia. AQA erakundeak dio prestakina normalean 5 minutu ingururen barruan koloregabetu behar dela 35 C-an; saiakuntzetako batez bestekoak 275 s izan ziren 20 C-an, 128 s 35 C-an eta 145 s 45 C-an. Muntaia jakin bateko adibideak dira, ez erreferentzia unibertsalak. Baldintza kontrolatuetan erredukzio-tasaren eta metabolikoki aktiboa den legamiaren arteko lotura kuantitatiboa erredukzioari buruzko azterketa espezifikoek babesten dute, besteak beste PMID 25773544 gisa indexatutako lanak eta Yeast aldizkariko azterketa mekanistikoak (2014).

Denboran zeharreko bilakaeraren erakustaldia (baliabide originala)

Beheko taula artikulu honetarako sortutako erakustaldi originala da, goian deskribatutako AQA estiloko muntaia erabiliz: legamia-glukosa nahastearen 2 mL gehi 0.001% inguruko lan-koloratzailearen 2 mL, 10 segundoz behin astintzea eta, ondoren, mugitu gabeko inkubazioa. Datuak adibidezko irakurketak dira, ikasle-talde batek erregistratu beharko lukeen formatuan; tasa-indizea 1 zati koloregabetze-denbora segundotan gisa definitzen da. Egin saiakuntza hodi berdinekin eta ordeztu datu hauek neurtutako balioekin.

Irudikatu tasa-indizea tenperaturaren arabera A, B eta C hodietarako. Kurba igo egiten da eta gero lautzen edo jaisten da; hori da entzimek eragindako espero den eredua, ez lerro zuzena. D, E eta F hodiak ez dira kurba horretako datu-puntuak. Kurba interpretatzea ahalbidetzen duten kontrolak dira.

Saiakuntza bakoitzari zentzua ematen dioten kontrolak

Arnasketa-saiakuntza bakoitzak hiru laguntzaile behar ditu. Legamia irakina edo hila, glukosa eta koloratzailea dituen nahasteak urdin mantendu behar du, erredukzio azkarra metabolismo biziaren mendekoa dela frogatzeko. Legamia bizia eta koloratzailea, glukosa gehitu gabe, substratuaren kontrola da; hala ere, espero izatekoa da koloregabetze motela, legamiak erreserba endogenoak kontsumitzen baititu. Glukosa eta koloratzailea, legamiarik gabe, lagin zuri kimikoa da, eta ezinbestekoa da, glukosak baldintza alkalinoetan metileno urdina erreduzitu baitezake zelularik egon gabe.

Bideragarritasun-zenbaketak beste kontrol mota bat behar du: prozedura konstante mantentzea. Koloratzailearen ama-disoluzio bera, nahaste-proportzio bera, tindaketa-tarte bera, ganbera-eremu bera eta kimuetarako eta ertzetarako arau berak; ahal denean, zenbaketa itsuan eginda. Bi operadoreen emaitzen artean hamar puntuko aldea dagoenean, lan-orriak normalean agerian uzten du arrazoia: denbora desberdinak, urdina sailkatzeko atalase desberdinak edo kimuetarako arau desberdinak. Zelula tindatuak prestatzeko eta behatzeko teknikak bakterioen tindaketa sinplearen metodoekin lotzen dira; koloratzaileak lagin mota desberdinetan zer markatzen duen jakiteko ikuspegi zabalagoa, berriz, mikroskopiako tindaketen atlasean dago. Edozein urdin-intentsitate kuantitatiboki irakurtzearen atzean dagoen fisikari dagokionez, baldintzak zehazten dituen xurgapen-erreferentziak azaltzen du zergatik adierazi behar diren koefiziente bakoitzarekin batera disolbatzailearen, pH-aren eta kontzentrazioaren baldintzak.

Aukeratu saiakuntza galderaren arabera. Une honetan zenbat zelula dauden bizirik zenbaketa-galdera bat da, eta mikroskopioan erantzuten da, lan-orri batekin. Kultura honek zenbateko jarduerarekin arnasten duen galdera zinetikoa da, eta kronometro batekin eta kontrolatutako hodiekin erantzuten da. Metileno urdinak bietarako balio du, baina inoiz ez hodi berean eta une berean.