Metileno urdina eta hanturazko seinaleztapena: inflamasomak, IL-6 eta STAT3

Demagun hiru laborategik jakinarazten dutela konposatu urdin berak hanturaren aurkako eragina duela. Batek makrofagoetatik IL-1beta gutxiago askatzen dela erakusten du. Beste batek zelula mota berean iNOS entzima gutxiago dagoela erakusten du. Hirugarrenak odolean IL-6 gutxiago eta garunean STAT3 jarduera txikiagoa dagoela erakusten du. Hiru emaitzak baieztapen bakarrean biltzeko tentazioa dago. Baina bateratze horrek aurkikuntza ezkutatzen du.

Emaitza bakoitza seinaleztapen-kontzeptu desberdin bati dagokio, eta bakoitzak bere abiarazlea, mihiztadura-urratsa eta neurketa-emaitza ditu. Metileno urdinak puntu desberdin batean eragiten du kontzeptu bakoitzean. Horietakoren batek osasun-emaitzak hobetzen dituen beste galdera bat da; gure metileno urdinari eta hanturari buruzko ikuspegi orokorrean lantzen dugu. Orrialde hau bideetara mugatzen da.

1. bidea: inflamasomaren mihiztadura eta kaspasa-1

Inflamasoma zelula mieloide baten barruan beharraren arabera eraikitzen den proteina-egitura bat da. Haren osagaiak sentsore bat, ASC izeneko egokitzaile bat eta kaspasa-1 izeneko entzima efektore bat dira. Mihiztatu ondoren, kaspasa-1ek pro-IL-1beta eta pro-IL-18 mozten ditu, jariatzen diren formak sortzeko, eta piroptosia abiaraz dezake, zelula-heriotzaren hanturazko forma bat. Sentsoreak zehazten du mota: NLRP3k kristalei eta poroak eratzen dituzten toxinei erantzuten die, hala nola nigerizinari eta ATPari; NLRC4k bakterioen flagelinari erantzuten dio; AIM2k zitosoleko kate bikoitzeko DNAri erantzuten dio; eta bide ez-kanonikoak zelula barneko lipopolisakaridoari erantzuten dio.

Aktibazioak bi seinale behar ditu. Lehen seinalea prestaketa da: Toll motako hartzaile baten ligandoak NLRP3ren eta pro-IL-1betaren NF-kBren mendeko transkripzioa bultzatzen du, osagaiak eskuragarri egon daitezen. Bigarren seinalea mihiztadura da: bigarren abiarazle batek ASC agregatu puntualak eratuz oligomerizatzea, kaspasa-1 bere p20 zatia sortzeko moztea eta IL-1beta p17 heldua askatzea eragiten du. Mitokondrioetako oxigeno-espezie erreaktiboak eta kristalen barneratzea NLRP3ren bigarren seinalean parte hartzen duten faktore ezagunak dira.

Inflamasomen inhibizio zabalari buruzko 2017ko makrofago-azterlanak metileno urdina probatu zuen bi seinaleetan. Lipopolisakaridoarekin prestatutako sagu-hezur-muineko makrofagoetan, nigerizinak, ATPak eta urato monosodikoaren kristalek IL-1beta eta kaspasa-1 askatzea eta ASC agregatu puntualak eratzea eragin zuten, bakoitzak bere aldetik. Metileno urdinak, 20 eta 200 micromolar arteko kontzentrazioetan, hirurak murriztu zituen dosiaren arabera, zelulak hil gabe. Eredu bera ikusi zen NLRC4rako flagelina eta Salmonella erabilita, AIM2rako kate bikoitzeko DNA eta Listeria erabilita, eta bide ez-kanonikorako transfektatutako lipopolisakaridoa edo E. coli bizia erabilita. Konposatuak bakarrik ez zuen askapenik eragin, eta kontrol-plakek ez zuten bakterioen aurkako eraginik erakutsi; beraz, emaitza ostalariaren erantzunari dagokio.

Bidean gorago, hiru esku-hartze neurtu ziren. Errotenonak eragindako superoxido mitokondriala gutxitu egin zen metileno urdinarekin, eta errotenonak eragindako IL-1beta askapena ere gutxitu egin zen harekin batera. Mikrosfera fluoreszenteen barneratzea murriztu zen, kristalak hauteman aurretik fagozitosia murriztearekin bat etorriz. NF-kBrentzako bi lotura-gune zituen NLRP3 sustatzaileak kontrolatutako erreportari batek jarduera txikiagoa erakutsi zuen metileno urdinarekin; gune horiek ez zituen sustatzaile laburtuak, aldiz, ez zuen erantzun. Zelularik gabeko saio-hodi batean, metileno urdinak zuzenean murriztu zuen giza kaspasa-1 birkonbinatzailearen jarduera ere. Konposatua prestaketan soilik edo aktibazioan soilik gehituta ere, IL-1beta, IL-18 eta kaspasa-1 askapena murriztu ziren; beraz, bi urratsek parte hartzen dute.

Saguekin egindako probak bat etorri ziren selektibitate horrekin. Lipopolisakaridoaren dosi hilgarri batek kontrol-saguak ordu gutxitan hil zituen; metileno urdinak, berriz, biziraupena hobetu zuen. Peritoneoko IL-1beta gutxitu zen, baina likido bereko IL-6 ez. Listeriak eragindako peritonitis-eredu batean, peritoneoko IL-1beta gutxitu zen, zelulen guztizko kopurua aldatu gabe. Giza THP-1 monozitoek sagu-makrofagoen antzeko portaera izan zuten lau inflamasoma motetan. Inflamasomari buruzko emaitza batek IL-1beta eta IL-18 heltzea azaltzen du, ez zitokina guztiak. Horregatik ere, mikroglia eta astrozitoen esperimentuetan garuneko immunitate-zelulen formak beste galdera bati erantzuten dio, ez egituraren mihiztadurari buruzkoari.

2. bidea: iNOSen transkripzioa NF-kB eta STAT1 lotzearen bidez

Oxido nitriko sintasa induzigarria, edo iNOS, ia ez dago atseden-egoeran, eta beharraren arabera transkribatzen da. Lipopolisakaridoak batez ere IkB-alfa degradatuz bultzatzen du prozesua; ondoren, NF-kB fosforilatu eta nukleora sartzen da. Interferon-gammak, berriz, batez ere Janus kinasak STAT1 fosforilatuz bultzatzen du; ondoren, STAT1 nukleora sartzen da. Faktore bakoitza iNOSen sustatzailean dagokion gunera lotzen da gero. Entzimaren jarduera eta genearen indukzioa kontrol-puntu bereiziak dira, eta farmako batek batean, bestean edo bietan eragin dezake.

Makrofagoetan eta sagu endotoxemikoetan iNOSen indukzioari buruzko 2015eko azterlanak RNA mezulariaren mailan kokatu zuen eragina. RAW 264.7 zeluletan eta sagu-makrofago primarioetan, lipopolisakaridoa, interferon-gamma edo biak eman baino 30 minutu lehenago emandako 1 micromolar metileno urdinak iNOS proteina eta mRNA murriztu zituen 8 eta 24 ordu bitartean, medioan nitrito gutxiago egonda eta bideragarritasuna galdu gabe. Kg bakoitzeko 25 mg lipopolisakarido jaso zuten saguetan, ordubete lehenago emandako kg bakoitzeko 5 mg-ko dosi bakar batek iNOS proteina eta mRNA murriztu zituen biriketan, gibelean eta bihotzean.

Xehetasun bereizgarria aldatu ez zena da. IkB-alfaren degradazioa, NF-kBren fosforilazioa, STAT1en fosforilazioa eta bi faktoreen nukleoko metaketa bere horretan mantendu ziren. Etena urrats bat geroago gertatu zen: nukleo-estraktuek erakutsi zuten lipopolisakaridoaren ondoren NF-kB gutxiago lotzen zela zegokion DNA elementura, eta interferon-gammaren ondoren STAT1 gutxiago lotzen zela. Kromatinaren immunoprezipitazioak baieztatu zuen zelulen barruan bi faktoreen okupazioa txikiagoa zela iNOSen sustatzailean. Tumore-nekrosiaren alfa faktorea ere gutxitu zen; haren sustatzaileak ere NF-kB erabiltzen du. Faktoreak aktibatu eta iritsi egin ziren, baina ahul lotu ziren beren xede-DNAra.

Kontuan hartu 1. bidearekiko aldea. Hau faktoreak DNAra lotzeari dagokio, STAT1 erabiltzen du STAT3ren ordez, eta mRNA, proteina eta nitritoa neurtzen ditu, ASC agregatu puntualak eta kaspasa-1 zatiak neurtu beharrean. Gure zelula-ereduetako metileno urdinaren xedeen mapak transkripzio-maila hori bereizita mantentzen du entzimen eta mitokondrioen zuzeneko neurketetatik.

3. bidea: serumeko IL-6 eta ehunetako STAT3 aktibazioa

IL-6k gp130 hartzaileen familiaren bidez transmititzen du seinalea Janus kinasatik STAT3rako kaskadara. STAT3 fosforilatua dimerizatu, nukleora sartu eta hanturazko programak bultzatzen ditu. IL-6 bera, berriz, NF-kBren xedea da; beraz, biek atzeraelikadura-begizta bat osatzen dute, sarritan IL-6tik STAT3rako ardatza deitua. Ohiko neurketa-emaitzak dira serumeko IL-6 bidean gorago, STAT3 fosforilatuaren eta guztizko STAT3ren arteko erlazioa, eta iNOS eta COX2 bezalako entzima efektoreak bidean beherago.

Lipopolisakaridoaren ondorengo IL-6ri eta STAT3ri buruzko 2023ko sagu-azterlanak ardatza hainbat konpartimentutan neurtu zuen. C57BL/6 sagu arrek kg bakoitzeko 1 mg lipopolisakarido jaso zuten egunero hiru egunez, eta kg bakoitzeko 5 edo 10 mg metileno urdin dosi bakoitzaren ondoren 30 minutura. Hirugarren egunean, serumeko IL-6 txikiagoa zen metileno urdina jaso zuten bi taldeetan lipopolisakaridoa soilik jaso zuten taldean baino; neurtutako gainerako zitokina gehienak, aldiz, ez ziren aldatu tratamenduarekin. STAT3 fosforilatuaren eta guztizko STAT3ren arteko erlazioak txikiagoak ziren kortexean, hipokanpoan eta belarriko azalean; gainera, mikrogliaren Iba-1 tindaketa txikiagoa zen, iNOS eta COX2 mailak txikiagoak ziren, eta pisu-galera neurri batean arindu zen.

Bi ohar egin behar dira hemen. Serumeko IL-6 txikiagoa eta ehunetako STAT3 fosforilazio txikiagoa bat datoz ardatzaren modulazioarekin, baina ez dute nodo nagusia bereizten: bidean gorago zitokina gutxiago egoteak, hartzaileen seinaleztapen txikiagoak edo fosfatasa-jarduera aldatzeak erlazio bera eragin lezakete. Gainera, estimulu akutuaren hiru egunetan zehar neurtutako pisua animalia osoaren neurketa-emaitza da, ez sintomen edo erremisioaren puntuazioa. Blot baten emaitzatik haragoko testuingurua ematen du, seinaleztapen-emaitza tratamenduari buruzko baieztapen bihurtu gabe. Mitokondrioetako erredox-prozesuen erregulazioaren kimika bereizia zitokinei buruzko azalpen honekin paraleloan gertatzen da, eta ez da harekin bateratu behar.

Bideen alderaketa: esku-hartze puntuak eta neurketa-emaitzak

Taulak hiru estrapolazio baliogabe eragozten ditu. ASC agregatu puntualei buruzko emaitza batek ez du STAT3ri buruzko emaitzarik frogatzen. STAT1 iNOSen sustatzailera lotzeari buruzko emaitza batek ez du STAT3ri buruzko emaitzarik frogatzen, nahiz eta bi proteinak STAT familiako kideak izan. Serumeko IL-6ri buruzko emaitza batek ez du inflamasomaren mihiztadura murriztu denik frogatzen: peritoneoko esperimentuan IL-1beta gutxitu zen, baina IL-6 ez. Errenkada bakoitzak bere abiarazlea eta neurketa-emaitza behar ditu; horregatik, metileno urdinari buruzko zelula-, animalia- eta azterlan klinikoak irakurtzean, ezinbestekoa da baieztapen bakoitza neurtutako mailarekin bat etortzea.

Horrek guztiak ez du pertsonentzako dosifikaziorik, segurtasunik edo onurarik ezartzen. Lipopolisakarido-ereduak mekanismo bat probatzeko abiarazle kontrolatuak dira, ez gaixotasun kronikoen erreplikak. Gainera, dosia abiarazlearekin batera emateak eragindako aldaketa baten prebentzioa probatzen du, ez jada ezarritako gaixotasun baten atzerabuelta. Mantendu mekanismoari buruzko azalpen hau pazienteen emaitzetatik bereizita, eta baloratu osasunari buruzko edozein baieztapen haren oinarrian dagoen paziente-azterlanaren arabera.